液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法

摘要

本发明公开了一种液相色谱‑串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法，属于检测方法技术领域，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)通过液相色谱‑串联质谱法测定经预处理后的苜蓿样品中19农药的残留量；该方法以乙腈作为提取溶剂，经QuEChERS提取管提取，QuEChERS净化管净化，采用LC‑MS/MS进行MRM监测分析，操作简单，可明显提高工作效率，该检测方法还具有准确度和灵敏度高、检出限低，线性关系好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苜蓿中多种农药残留的检测方法，尤其是涉及一种通过液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法。

背景技术

苜蓿由于其多年生、枝叶茂盛、营养价值高等生物学特性，为昆虫提供了一个相对稳定、适宜的生存环境，害虫和天敌种类均很丰富，被誉为昆虫资源库。其中害虫种类主要有蚜虫类、蓟马类、盲蝽类等，对苜蓿生产造成严重威胁，化学农药控制害虫危害仍然是农业上采用的重要方法之一，故使苜蓿上存在一定的药物残留量，如甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、辛硫磷等。

甲萘威，全名1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯，又名西维因，是一种氨基甲酸酯杀虫剂，用于稻、棉、果林茶桑等作物上的螟虫、稻纵卷叶螟、稻苞虫、棉铃虫、红铃虫、斜纹夜蛾、棉卷叶虫、桃小食心虫、苹果刺蛾、茶小绿叶蝉、茶毛虫、桑尺蠖、大豆食心虫等，甲萘威具有触杀及胃毒作用，能抑制害虫神经系统的胆碱酯酶使其致死。

亚胺硫磷：广谱性有机磷杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，对植物组织有一定的渗透性。用于水稻、棉花、果树等作物。可防治棉铃虫、棉红蜘蛛、红铃虫、稻叶蝉、稻飞虱、稻纵卷叶螟。

氧化萎锈灵：防治锈病的内吸杀菌剂，对谷物、蔬菜的锈病有效，兼具预防和治疗作用。

甲基硫菌灵：商品名甲基托布津，是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，具有内吸、预防和治疗作用。

二嗪磷：广谱性杀虫剂，具有触杀、胃毒、熏蒸和一定的内吸作用，也有较好的杀螨与杀卵作用。广泛用于水稻、玉米、甘蔗、烟草、果树、蔬菜、牧草、花卉、森林和温室，用来防治多种刺激吸性和食叶性害虫，也用于土壤，防治地下害虫和线虫，还可用于防治家畜体外寄生虫和蝇类、蟑螂等家庭害虫。

甲基异柳磷：化学名称为N-异丙基-O-甲基-O-[(2-异丙氧基羰基)苯基]硫代磷酰胺酯，一种土壤杀虫剂，对害虫具有较强的触杀和胃毒作用。杀虫广谱、残效期长，是防治地下害虫的优良药剂。

异丙威：主要用于防治水稻飞虱和叶蝉科害虫，击倒力强、药效迅速，但残效期较短，一般只有3-5天。可兼治蓟马和蚂蟥，对稻飞虱天敌蜘蛛类安全。对甘蔗扁飞虱、马铃薯甲虫、厩蝇等也有良好防治效果。

辛硫磷：国际通用名称为Phoxim，是生产中常用的广谱性有机磷杀虫剂。利用辛硫磷的胃毒、触杀和在黑暗条件下残效长等特性，防治天牛等蛀干性害虫，符合环保、经济、安全和高效的原则。

根据上述农药的描述可以看出苜蓿生长过程中使用最多的农药是有机磷类农药，经研究发现苜蓿等饲草中的农药残留不仅能在畜禽体内蓄积，还能迁移到畜乳中，直接影响到肉、蛋、奶的质量，从而对人体质量构成威胁，因此，开发一种快速准确的检测技术，对监管苜蓿等饲草中的农药残留状况、促进畜牧业发展意义重大，现有技术中也报道了一些对农药残留的检测方法。

例如，中国专利申请201310415229.7中公开了一种液相色谱串联质谱/质谱法同时测定棉花中多种农药残留的方法，所采用的方法如下：1)试样处理；2)测定：采用液相色谱串联质谱/质谱法；3)空白试验；4)结果计算和表述：按公式计算试样中各个农药含量：式中：X—试样中各个农药的含量，单位为毫克每千克；C—由标准工作曲线得到样液各个农药的浓度，单位为微克每毫升；V—样液最终体积，单位为毫升；m—最终样液所代表的试样量，单位为克。本发明的测定方法采用液相色谱串联质谱/质谱法同时测定棉花中多种农药残留，方法简便、快速、准确、可靠，检测限、回收率和精密度均符合要求。

又如，中国专利申请201110066713.4中公开了一种液相色谱-串联质谱法测定人参中农药残留量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)对待测人参样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种农药的残留量。该测定方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于人参或类似药材中农药的多成分残留量的测定。

但是根据现有技术的研究，发现针对苜蓿中农药残留的测定少之又少，苜蓿作为一种常见的饲草农药残留不仅能在畜禽体内蓄积，还能迁移到畜乳中，直接影响到肉、蛋、奶的质量，从而对人体质量构成威胁，因此亟需开发一种快速准确的检测苜蓿中农药残留的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，弥补采用液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的空白，本发明目的在于提供一种液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法，该检测方法具有准确度和灵敏度高、检出限低，线性关系好的优点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法，所述的19种农药为敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威和辛硫磷；所述的方法包括以下步骤：

(1)样品前处理

所述的样品前处理步骤为：称取苜蓿样品粉末，加水浸泡，加入乙腈混匀，然后萃取，振荡，离心，取上清液净化，振荡，离心，最后取上清液和水混匀后过滤，供液相色谱-串联质谱测定；

所述的样品前处理步骤中在加入乙腈的同时还可以加入均质子；

所述的萃取可以在混合液中加入QuEChERS萃取盐包；所述的净化可以在QuEChERS净化包中进行；

所述的样品前处理步骤中所述的离心速率为5000-10000r/min，所述的离心时间为5-10min；

优选地，所述的离心速率为6000-8000r/min，所述的离心时间为6-8min；

再优选地，所述的离心速率为7000-8000r/min，所述的离心时间为6-7min。

所述的样品前处理步骤中所述的上清液和水的体积比为1:1-2；优选为1:1。

(2)色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5 100A柱，50-100mm×3.0mm×2.6μm；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B含0.1％甲酸乙腈溶液，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：25-35℃；

优选地，所述的色谱柱为Phenomenex Kinetex F5 100A柱，50mm×3.0mm×2.6μm；

优选地，所述的色谱条件中的进样量为5μL；

优选地，所述的柱温为柱温：30-35℃，进一步优选为30℃；

梯度洗脱条件如下：

(3)质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：5500V；离子源温度：400-500℃；雾化气压力：50psi；气帘气压力：10psi；辅助气压力：55psi；采集方式：多反应监测模式(MRM)；

优选地，所述的质谱条件中电喷雾电压为5500V，

优选地，所述的离子源温度450-500℃；再优选为450℃；

优选地，所述的质谱条件中雾化气压力为50psi，气帘气压力为10psi，辅助气压力为55psi。

19种农药的质谱条件如下：检测离子对、去簇电压(DP)、碰撞能(CE)

下划线离子对为定量离子对。

其中上述方法中还包括配制标准溶液，所述的配制标准溶液包括配制标准储备液和混合标准液；

所述的标准储备液的配制方法为：分别取0.2mg19中农药标准品用乙腈溶解，配制成浓度为20mg/L的标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

所述的混合标准液的配制方法为：分别移取1ml上述19种的标准储备液配制成浓度为0.8mg/L的混合标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

在一个优选实施方案中，上述测定方法通过以下方案实现：

一种液相色谱-串联质谱法测定苜蓿中19种农药残留的方法，所述的所述的19种农药为敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威和辛硫磷；所述的方法包括以下步骤：

1、配置标准溶液

1.1配制标准储备液

分别取0.2mg19种农药标准品(敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威、辛硫磷)于烧杯中，用乙腈溶解，溶解液全部转移至10mL的容量瓶中，烧杯用乙腈润洗3次，润洗液全部转移至容量瓶中，用乙腈定容，配制成浓度为20mg/L的标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用；

1.2配制混合标准液

分别准确移取1ml的上述19种农药的标准储备液至25ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.8mg/L的混合标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

2、样品前处理

称取2.00g经粉碎后的苜蓿样品于50ml离心管中，加入10mL水浸泡并平衡2min，加入10mL乙腈和4颗均质子涡旋混匀1min，在样品中加入QuEChERS萃取盐包剧烈振荡1min，然后经8000r/min离心10min，分离提取液，将5ml提取液转移至15mlQuEChERS净化包，涡旋振荡1min，8000r/min离心5min，分离上清液，取0.5mL上清液和0.5mL水置于1.5ml离心管中，涡旋混匀后，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定；

3、色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5 100A柱，50mm×3.0mm×2.6μm；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B含0.1％甲酸乙腈溶液，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；梯度洗脱条件见表1：

表1梯度洗脱条件

(4)质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：5500V；离子源温度：450℃；雾化气压力：50psi；气帘气压力：10psi；辅助气压力：55psi；采集方式：多反应监测模式(MRM)；19种农药的质谱条件如下：检测离子对、去簇电压(DP)、碰撞能(CE)

表2 19种农药的质谱条件

下划线离子对为定量离子对。

本发明采用上述的技术方案，建立了同时测定苜蓿中19种农药(敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威和辛硫磷)的液相色谱-串联质谱法测定方法，样品以乙腈作为提取溶剂，经QuEChERS提取管提取，QuEChERS净化管净化，采用LC-MS/MS进行MRM监测分析。结果表明，该方法在0.25-20ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997，平均加标回收率在72.8％-118.5％，相对标准偏差为0.6％-19.3％，19种农药方法检出限为0.01-0.5ng/mL，定量限为0.02-1ng/mL，在添加水平为0.02μg/mL时，除多菌灵以外18种农药表现为基质抑制效应(30.9％-91.3％)。其中仲丁灵、烯唑醇、甲霜灵受基质抑制干扰较低；敌草隆、马拉硫磷、乐果、三唑酮、甲硫威、嘧菌酯、吡虫啉表现为中等程度的基质抑制效应，多菌灵为中等程度的基质增强效应；甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、辛硫磷均表现为强烈的基质抑制效应。研究表明，建立的QuErChERS-液相色谱-串联质谱法能够对苜蓿中19种农药残留进行快速、简便、准确的测定。

附图说明

图1为2.5μg/kg基质加标谱图；

图2为5μg/kg基质加标谱图；

图3为20μg/kg基质加标谱图；

图4为50μg/kg基质加标谱图；

图5为100μg/kg基质加标谱图；

图6为200μg/kg基质加标谱图；

图7为0.5ng/mL多菌灵谱图；

图8为0.5ng/mL异丙威谱图；

图9为0.5ng/mL甲萘威谱图；

图10为0.5ng/mL甲硫威谱图；

图11为0.5ng/mL乐果谱图；

图12为0.5ng/mL敌草隆谱图；

图13为0.5ng/mL吡虫啉谱图；

图14为0.5ng/mL氧化萎锈灵谱图；

图15为0.5ng/mL甲霜灵谱图；

图16为0.5ng/mL三唑酮谱图；

图17为0.5ng/mL仲丁灵谱图；

图18为0.5ng/mL辛硫磷谱图；

图19为0.5ng/mL二嗪磷谱图；

图20为0.5ng/mL亚胺硫磷谱图；

图21为0.5ng/mL烯唑醇谱图；

图22为0.5ng/mL马拉硫磷谱图；

图23为0.5ng/mL甲基异柳磷谱图；

图24为0.5ng/mL甲基硫菌灵谱图；

图25为0.5ng/mL嘧菌酯谱图。

具体实施方式

1、实验部分

1.1仪器与试剂

API4000液相色谱串联质谱仪(美国SCIEX)，离心机(日本Hitachi)，涡旋混合器(美国Scilogex)，分析天平(德国Sartorius)。

19种农药标准品(敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威、辛硫磷)购自德国Dr.Ehrenstorfer和美国Sigma－aldrich(纯度99.0％)；乙腈为色谱纯(美国Sigma Aldrich)；甲酸为色谱纯(美国Dikma Pure)；实验室用水为超纯水；均质子(天津Agela Technologies)；QuEChERS萃取盐包即QuEChERS提取管(50ml，内含6g无水硫酸镁和1.5g无水乙酸钠，MS-MG5052)和QuEChERS净化管(15ml，内含1200mg无水硫酸镁、400mgPSA、60mgPC、400mgC18，MS-9PP0264)均购自天津Agela Technologies。

1.2配置标准溶液

1.2.1配制标准储备液

分别取0.2mg19种农药标准品(敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威、辛硫磷)于烧杯中，用乙腈溶解，溶解液全部转移至10mL的容量瓶中，烧杯用乙腈润洗3次，润洗液全部转移至容量瓶中，用乙腈定容，配制成浓度为20mg/L的标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用；

1.2.2配制混合标准液

分别准确移取1ml的上述19种的标准储备液至25ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.8mg/L的混合标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

1.3样品前处理

称取2.00g经粉碎后的苜蓿样品于50ml离心管中，加入10mL水浸泡并平衡2min，加入10mL乙腈和4颗均质子涡旋混匀1min，在样品中加入QuEChERS萃取盐包剧烈振荡1min，然后经8000r/min离心10min，分离提取液，将5ml提取液转移至15mlQuEChERS净化包，涡旋振荡1min，8000r/min离心5min，分离上清液，取0.5mL上清液和0.5mL水置于1.5ml离心管中，涡旋混匀后，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定；

1.4色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5 100A柱，50mm×3.0mm×2.6μm；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B含0.1％甲酸乙腈溶液，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；梯度洗脱条件见表1：

表1梯度洗脱条件

(4)质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：5500V；离子源温度：450℃；雾化气压力：50psi；气帘气压力：10psi；辅助气压力：55psi；采集方式：多反应监测模式(MRM)；19种农药的质谱条件如下：检测离子对、去簇电压(DP)、碰撞能(CE)

表2 19种农药的质谱条件

下划线离子对为定量离子对。

2、结果与讨论

2.1方法的线性范围、检出限和定量限

试验过程中，用基质空白溶液逐级稀释，配成不同质量浓度的基质匹配标准工作液。配制的敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、吡虫啉、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威、甲硫威和辛硫磷等19种混合标准工作液质量浓度分别为0.25、0.5、1、2、5、10、20ng/mL，需现用现配，按照本发明提供的方法进行测定，以目标物的峰面积(Y)对相应质量浓度(X)绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。按照所建立的色谱条件和工作方法进行分析，根据定量离子信噪比(S/N)分别为3和10时对应的样品中待测目标物的浓度得到检测限和定量限，检测结果见下表3。

表3 19种农药线性方程、检出限(S/N＝3)和定量限(S/N＝10)

由表3的检测结果可知，19种农药峰形良好，在苜蓿基质空白混合标准溶液中呈现良好的线性关系，相关系数R²>0.997；检出限浓度在0.01-0.5ng/mL范围内均满足3倍噪音比要求，定量限为0.02-1ng/mL范围内均满足10倍噪音比要求，符合多种农药残留分析要求。

2.2方法的回收试验和精密度

向空白苜蓿样品中准确加入19种农药混合标准工作液，制备6个添加水平的苜蓿样品。每个浓度每一批次进行5个平行试验，分别进行3个批次。按按照本发明公开的样品前处理方法进行苜蓿样品的提取和净化，经本发明公开的色谱条件和工作方法进行分析测定，采用基质匹配混合标准工作液进行外标定量，计算添加回收率和相对标准偏差，检测结果见下表4。

表4 苜蓿基质不同浓度回收率及相对标准偏差(n＝6)

由表4的检测结果可知，当加标量为2.5μg/kg时，除敌草隆、亚胺硫磷、甲萘威、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、吡虫啉、异丙威和甲硫威异丙威外，其他目标化合物的加标回收率为77.4％-103.3％；精密度除敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、甲萘威、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、多菌灵、吡虫啉、甲硫威和辛硫磷外，其他目标化合物的相对标准偏差在3.4％-19.3％。当加标量为5μg/kg时，除甲基硫菌灵、多菌灵和辛硫磷外，其余目标物的回收率在78.2％-111.3％范围内；精密度除敌草隆、马拉硫磷、多菌灵、吡虫啉和辛硫磷外，其他目标物的相对标准偏差在2.1％-18.6％。当加标量为20μg/Kg时，19种农药的加标回收率在86.7％-117.3％；相对标准偏差为0.6％-18.5％。当加标量为50μg/kg时，19种目标化合物的加标回收率为85.4％-106.4％；相对标准偏差在4.0％-14.0％。当加标量为100μg/kg时，19种目标物的回收率在83.4％-110.4％；相对标准偏差为2.4％-16.0％。当加标量为200μg/kg时，19种目标物的回收率在83.6％-112.9％；相对标准偏差为1.3％-13.6％。本试验方法的回收率和精密度均满足农药残留分析方法要求。

2.3方法的基质效应

由于苜蓿样品基质较为复杂，经过前处理后在分析液中仍存在内源性组分(有机和无机成分)，其会对分析化合物的离子化程度产生很大影响，因此，本研究考察了苜蓿基质中分析化合物的基质效应，采用提取后添加法，添加水平为0.02μg/mL，按照本发明公开的样品前处理方法提取净化得到的基质空白溶液稀释标样作为基质标样，该浓度的标准工作液作为溶剂标样。按本发明公开的色谱条件和工作方法进行分析测定，记录各种农药的峰面积，按基质效应计算公式进行评价(如公式(1)所示)。若A/B＞1，则表示基质增强效应；若A/B＜1，则表示基质抑制效应；若A/B＝1，则表示不存在基质效应。当A/B为0.8～1.2时，基质干扰程度较低；当0.5＜A/B＜0.8或1.2＜A/B＜1.5时，表现为中等程度的基质干扰效应；当A/B＜0.5或A/B＞1.5，表示基质效应的干扰强烈。

式中：A为基质匹配标准品的峰面积；B为纯标准品的峰面积，基质效应评价结果见表5。

表5 苜蓿基质种19种农药的基质效应

由表5的检测数据可知，19种农药中有18种的基质效应为30.9％-91.3％，表现为基质抑制效应；只有多菌灵的基质效应为126.0％，表现为基质增强。其中仲丁灵、烯唑醇和甲霜灵受基质抑制干扰较低；敌草隆、马拉硫磷、乐果、三唑酮、甲硫威、嘧菌酯和吡虫啉表现为中等程度的基质抑制效应，多菌灵为中等程度的基质增强效应；甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威和辛硫磷均表现为强烈的基质抑制效应。本次试验利用基质空白匹配标准溶液进行定量分析，有效消除了基质效应带来的影响，满足苜蓿中农药残留分析的要求。

3、结论

综上，本发明利用QuErChERS前处理技术结合LC/MS方法进行苜蓿中19种农药残留分析检测。该方法灵敏度高、简便、快速、准确、有机溶剂消耗量少；19种农药在0.25-20ng/mL范围内线性良好；回收率和精密度均满足农药多残留分析检测要求。另外，对苜蓿样品检测时的基质效应进行分析，检测的19种农药中，16种农药受基质效应影响较大，其中7种农药表现为中等程度的基质抑制效应，1种农药表现为中等程度的基质增强效应干扰，其余的8种农药表现为强烈的基质抑制效应。因此，在苜蓿样品检测过程中需利用基质匹配混合标准工作液的方法来消除或补偿基质效应，这给我国苜蓿的风险评估、进出口的检测等研究提供了一种高效、快速的分析手段。