微藻共栖细菌分离培养基、分离方法以及影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法

摘要

本发明涉及微藻共栖细菌分离领域，具体而言，涉及微藻共栖细菌分离培养基、分离方法以及影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法。一方面，本发明提供一种微藻共栖细菌分离培养基，基于常用海洋细菌分离培养基—Zobell 2216E海洋肉汤细菌培养基进行改良，提供一种可实现增加微藻藻际共栖细菌可培养细菌种类的培养基，为筛选影响微藻生长关键细菌提供丰富的菌种资源。另一方面，本发明提出一种高通量快速筛选显著促藻或抑藻生长细菌的方法，能在短时间内发现对微藻生长有关键影响的细菌。

说明书

技术领域

本发明涉及微藻共栖细菌分离领域，具体而言，涉及微藻共栖细菌分离培养基、分离方法以及影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法。

背景技术

自然水环境以及微藻的应用培养过程中，藻类与细菌间存在密切关系，部分细菌对藻类生长具有关键影响。1972年，微藻生物学家Bell和Mitchell提出藻际环境(Phycosphere)的概念(Bell&Mitchell,1972)。与植物根际微生物对植物生长影响相类似，藻际也常栖息着特殊类群的细菌，对微藻的生长及生理形态起着重要调节作用。在海洋生态原位研究以及实验室藻菌共培养研究中，发现部分藻际细菌对微藻生长具有显著的促进或抑制作用，细菌与微藻的相互作用覆盖所有可能的共生形式(Ramanan et al.,2016)，细菌是微藻应用与科学研究中不可忽略的因素。快速发现影响微藻生长的关键细菌以及藻菌互作关系，不仅可在微藻应用中识别藻类“益生细菌”或“病害细菌”从而提高微藻生物量产率获得直接的经济效益，并且有利于联合利用藻菌关系在环境治理，开发新型生物活性物质和生物资源等方面发挥作用。

发现与筛选影响微藻生长的关键细菌整体分为两部分：一是藻际细菌的分离培养；二是从分离得到的纯培养菌株中筛选对微藻生长起关键作用的细菌。海洋细菌分离培养广泛采用Zobell 2216E培养基，其中碳源氮源的蛋白胨、酵母膏用量较大，营养物质较为单一，适合快速繁殖的海洋细菌分离。而微藻藻际环境微生物类群及代谢类型众多，常规Zobell 2216E培养基分离得到藻际细菌过少，给藻际关键细菌的筛选带来困难。

目前筛选对微藻生长有关键影响的细菌方法主要采用三角烧瓶接种微藻和细菌的纯培养物进行共培养，定期取样检测微藻的生物量的方法来判断细菌对微藻的生长影响。由于藻际细菌种类繁多，使得该方法的人力物力需求量大，筛选效率低。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于建立一套联合藻际细菌高效分离培养基、分离方法及关键细菌高通量筛选的方法。

一方面，本发明提供一种微藻共栖细菌分离培养基，基于常用海洋细菌分离培养基—Zobell 2216E海洋肉汤细菌培养基进行改良，提供一种可实现增加微藻藻际共栖细菌可培养细菌种类的培养基，为筛选影响微藻生长关键细菌提供丰富的菌种资源。

另一方面，本发明提出一种高通量快速筛选显著促藻或抑藻生长细菌的方法，能在短时间内发现对微藻生长有关键影响的细菌。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种微藻共栖细菌分离培养基，以溶剂的体积计，包括以下组分：蛋白胨2.5±0.2g/L，酵母提取物0.5±0.05g/L，柠檬酸铁0.005±0.0005g/L，甲胺盐酸盐1±0.01g/L，f/2培养基母液1±0.2mL/L；

所述溶剂为人工海水或其类似物。

其中，人工海水的类似物是指只要用于培养藻类并使之按正常状态存在的盐类混合溶液均可。

进一步地，所述微藻共栖细菌分离培养基为固体培养基，所述培养基还包括琼脂15±0.01g/L。

本发明中提供的微藻共栖细菌分离培养基，除了f/2培养基外，其他组分搅拌均匀后121℃，高压灭菌15-30分种。冷却至60℃左右时，添加f/2培养基。

其中，以溶剂蒸馏水的体积计，所述人工海水配方如下：NaCl 24±0.5g/L，MgCl₂·6H₂O>2SO₄>2·6H₂O>3BO₃>3·9H₂O>2·6H₂O>4NO₃>3PO₄·4H₂O>

进一步地，以溶剂蒸馏水的体积计，所述f/2培养基母液的配方如下：NaNO₃>2PO₄·H₂O>2SiO₃·9H₂O>3·6H₂O>4·5H₂O>4·7H₂O>2·6H₂O>2·4H₂O>2MoO₄·2H₂O0.07±0.02g/L，维生素B1>

即本发明保护微藻共栖细菌分离培养基的液体培养基，也保护固体培养基。

据文献报道只利用单碳化合物作为碳源的细菌在海洋中普遍存在。这类细菌能够氧化并利用甲胺进行异养生长，且在外源提供甲胺的前提下才能被检测到。因此为了尽可能充分的分离到微藻共栖细菌，需要在分离培养基中添加甲胺类化合物。

海洋藻类常采用f/2海水培养基进行培养，因此，我们认为海洋藻类共栖息细菌对f/2培养基中某些物质具有偏好性。

本发明通过在培养基中添加了甲胺盐酸盐和海洋藻类培养所需的f/2培养基成分，使得利用单碳作为碳源的微生物和藻类栖息细菌能被更多地分离培养出来。

环境细菌分离时若培养基碳氮源营养浓度比较高，少量能快速调整代谢的微生物种类会迅速生长，形成菌落快速占据培养基表面，并由此抑制了其它种类微生物生长。而海水温度较低使得大部分类群海洋细菌生长较为缓慢，在有机物丰富且碳源种类单一的固体培养基上很难与生长快的细菌竞争生长空间。所以为获得种类丰富的细菌单克隆菌落，需要调整细菌分离培养基有机物浓度。

本发明提供的培养基采用较低浓度的营养物，降低培养温度，延长培养时间，协调了较快和较慢生长细菌种类形成菌落的时间及培养基空间可利用性，因此增加了培养基平板生长细菌的种类，有利于海洋细菌研究及海洋微生物资源的开发。

根据以上原理及实验验证，本发明对基于Zobell 2216海洋肉汤细菌培养基配方对海洋细菌分离培养基进行优化，得到上述的微藻共栖细菌分离培养基。该培养基设置藻类生长所需的环境条件，增加不同种类的细菌生长，并且加大不同细菌之间的区分性，使得藻共栖细菌尤其是藻共生菌能更好地得到分离培养。

本发明还提供了一种微藻共栖细菌分离方法，采用上述的微藻共栖细菌分离培养基培养待分离细菌的微藻，经分离得到细菌菌株，构建微藻共栖细菌菌株库。

利用本发明优化的海洋藻类共栖细菌分离培养基分离纯化微藻培养液共栖细菌，获得并保存纯培养细菌单克隆菌株，建立待筛选藻际共栖细菌库。

经试验发现，本发明提供的微藻共栖细菌分离培养基能得到更多细菌种类，为筛选影响微藻生长关键细菌提供丰富的菌种资源。

本发明中的分离采用划线分离。

本发明还提供了一种影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法，包括以下步骤：

确定微藻接种浓度范围，制得微藻母液；

确定细菌浓度接种范围，制得细菌母液，所述细菌来自上述的细菌菌株库；

所述细菌母液与所述微藻母液混合培养，同时设置不添加细菌母液的阴性对照组；

在培养过程中，监测不同组微藻的浓度，通过与阴性对照组比较，得到促进或抑制微藻生长的关键细菌。

进一步地，微藻的浓度根据混合培养中的微藻细胞量与微藻中色素荧光值的线性关系来确定。

通过检测色素荧光值的方式测定微藻的浓度，方法更简便。

进一步地，所述微藻中色素荧光值的测定采用酶标仪进行。

进一步地，所述微藻的接种范围为：1.8×10⁴cells/mL-1.0×10⁸cells/mL。

进一步地，所述微藻包括微拟球藻、紫球藻、三角褐指藻和小球藻中的至少一种。

进一步地，待测微藻培养至对数生长期，离心收集藻细胞后用f/2培养基再悬浮，制得微藻母液。

如本发明中的微藻选用模式微藻微拟球藻，确定微藻接种范围步骤如下：

通过血球计数板在光学显微镜下或使用流式细胞仪对不同浓度的微藻细胞计数，同时利用酶标仪以激发光为488nm发射光为680nm检测各个浓度藻细胞对应的叶绿素荧光值，建立微藻细胞数量与叶绿素荧光值线性关系标准曲线，获得藻细胞数量与酶标仪检测到的叶绿素荧光值相关性良好的范围区间，将此区间的对应的微藻细胞数量下限值作为微藻接种初始浓度的下限及比上限值低一个数量级的藻细胞数量作为微藻接种初始浓度上限值。

本发明中，用f/2人工海水培养基将待测海洋微藻培养至对数生长期，离心收集藻细胞，所用离心力为3000g，时间为5min；然后用人工海水对收集的菌体离心清洗三次，所得菌体用f/2人工海水培养基再悬浮，制备成微藻母液待用。

进一步地，所述确定细菌浓度接种范围步骤为：不同浓度细菌与微藻混合，测定混合物微藻色素荧光值，与相应的微藻的色素荧光值比较，同时排除自发荧光的菌株，确定细菌浓度接种范围。

具体地，确定细菌接种浓度范围：设置不同细菌浓度梯度，与藻液(如微拟球藻)混合后利用酶标以激发光为488nm发射光为680nm检测各个接种细菌浓度下藻液叶绿素荧光值，将对藻的叶绿素荧光值影响的细菌接种浓度作为细菌接种浓度的上限。

经试验发现，细菌浓度添加量过高，则会影响微藻色素荧光值，不便于确定微藻浓度。如选用微拟球藻，因其叶绿素荧光值稳定，荧光透射能力强，一般小于5×10⁹cells/mL以下浓度的细菌不会对藻液叶绿素荧光值产生显著干扰。

进一步地，所述细菌浓度的接种范围不大于5×10⁹个/mL。

本发明中，由于微藻依赖其自身携带的色素在一定条件下的荧光值确定其数量，因此，需要排除自发荧光的菌株，以防止其对微藻数量检测的影响。

进一步地，待筛选细菌菌株采用上述的微藻共栖细菌分离培养基扩繁培养至对数生长后期，离心收集菌体后用f/2人工海水培养基再悬浮，制得细菌母液。

本发明菌株培养时，采用本发明提供的微藻共栖细菌分离液体培养基进行。培养条件为150rpm，28℃。离心收集菌体，所用离心力为3500g，时间为5min。然后用人工海水对收集的菌体离心清洗三次，所得菌体用f/2人工海水培养基再悬浮，制备成细菌母液待用。

进一步地，细菌母液与微藻母液培养5-15天。

共培养的天数根据微藻的生长速度以及接种量来选择。

进一步地，细菌母液与微藻母液在24-96孔板中培养。如在不同的实施例中，可以选用24孔板、48孔板、96孔板等。这些培养板均有市售的细胞培养板。本发明选用的培养板为透明底，有盖，壁为黑色。

进一步地，细菌母液与微藻母液分别设置不同的浓度进行混合培养。

为了更快速的分析细菌与微藻培养情况，以判定细菌是否具有影响微藻生长的性能，进一步地，细菌母液与微藻母液的设置梯度均为5-10倍，设置梯度的个数为2-5个。

如，根据上述得出的有效接种范围，96孔板的每列以10倍浓度梯度递增接种细菌，每行以10倍浓度梯度递增接种微藻，并设置纯培养藻液作为空白对照，进行培养。

进一步地，培养过程中，每2-3天检测一次微藻的浓度。

为防止藻菌细胞沉淀，在微孔中加入无菌玻璃珠，并每日轻微震动培养板，将藻菌共培养物摇匀。

另外，需要说明的是，在进行酶标仪检测时，混匀后进行检测，以减少检测误差。

进一步地，细菌母液与微藻母液混合培养条件为：22±2℃，光强为70±2μmol/m²/s¹，二氧化碳浓度(v/v)2±0.05％。

即本发明将接种藻菌共培养物的培养板置于光照二氧化碳培养箱连续培养，培养条件为：22±2℃，光强为70±2μmol/m²/s¹，二氧化碳浓度(v/v)2±0.05％。

本发明根据建立的微藻细胞数量与叶绿素荧光值线性关系标准曲线，将检测记录的叶绿素荧光值转换为对应的微藻细胞数量，计算每个独立微孔藻在共培养期间的生长速率，将接种各种细菌及各个菌浓度梯度的共培养微藻生长速率与纯培养微藻的最大生物量及生长速率进行对比，从而确定各种细菌对微藻生长影响—促进或抑制微藻生长，以及产生影响的细菌接种浓度。

本发明优化的海洋藻类共栖息细菌分离培养基是基于海洋藻类共栖息细菌中细菌偏好藻类培养基营养物质和培养条件，且有些细菌种类利用单碳专性甲胺营养进行生长的理论，在培养基中添加甲胺盐酸盐和微藻培养常用的f/2培养基成分，通过增加12h:12h光暗循环的弱光光照(20μmol/(m2·s))的培养条件，使得适应藻类生长环境的藻类共栖息微生物能更多地分离出来。此外，本发明还调低了营养物的浓度，降低培养温度，延长培养时间，使得生长缓慢的微生物种类得以形成可见、可分离的菌落，从而增加了可分离培养的藻共栖息细菌的多样性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)在培养基中添加了甲胺盐酸盐和海洋藻类培养所需的f/2培养基成分，使得利用单碳作为碳源的微生物和藻类栖息细菌能被更多地分离培养出来。

(2)培养基采用较低浓度的营养物，降低培养温度，延长培养时间，协调了较快和较慢生长细菌种类形成菌落的时间及培养基空间可利用性，因此增加了培养基平板生长细菌的种类，有利于海洋细菌研究及海洋微生物资源的开发。

(3)培养基通过设置藻类生长所需的环境条件，使得藻共栖细菌尤其是藻共生菌能更好地得到分离培养。

(4)本发明提供的影响微藻生长关键细菌的高通量筛选方法基于在培养板培养，采用微藻和细菌梯度接种法，利用微藻叶绿素自发荧光值检测藻生长量，通过与纯培养微藻对比判断接种不同细菌浓度及不同藻菌细胞比例下的细菌对藻生长影响，可快速发现对微藻生长影响最为显著的细菌菌株。

(5)本发明具有针对性强、周期短、高通量的特点，且不受细菌浓度干扰，无需取样操作简便，在线性关系范围内微藻叶绿素荧光值与微藻生物量能有效换算。同时，本发明采用细胞培养板如96孔板对不同细菌接种浓度下藻生长量的测定，更加清楚促藻或抑藻所需的细菌浓度，灵敏性更高，对影响微藻生长的益生细菌或致病细菌检出性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1涉及的荧光显微镜检测藻际细菌的存在图；

图2为本发明实施例1中本发明提供的培养基分离得到的微藻共栖细菌(24种)系统进化树图谱；

图3为本发明实施例1中2216E培养基分离得到的微藻共栖细菌(18种)系统进化树图谱；

图4为本发明实施例2中微藻细胞数量与叶绿素荧光值线性关系标准曲线图；

图5为本发明实施例2中共培养操作流程图；

图6为本发明实施例2中不同培养孔中藻体生长情况图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种海洋微藻培养液中微藻共栖细菌分离方法，步骤如下：

1、培养基

本发明固体培养基：蛋白胨2.5g,酵母提取物0.5g,柠檬酸铁0.005g，甲胺盐酸盐1g，人工海水1L，琼脂15g，搅拌均匀后121℃，高压灭菌20分种。冷却至60℃左右时，添加f/2母液1ml/L，小心混匀以免产生大量气泡，倾倒平板，凝固后待用。

2216E固体培养基：商品化的2216E粉末37.4g，琼脂15g，蒸馏水1000ml搅拌均匀后121℃，灭菌20分钟，冷却至60℃，倒平板，凝固干燥后待用(作为对照)。

从4株微藻Porphyridium cruentum CCMA-143、Phaeodactylum tricornutumCCMA-267、Chlorella sp.CCMA-410、Chlorella sp.NAt01培养液中分别取1mL微藻培养液，加入10μl sybr green荧光染料，染色15分种，用荧光显微镜检测藻际细菌的存在(图1，图1a为Chlorella sp.CCMA-410培养液；图1b为Phaeodactylum tricornutum CCMA-267；图1c为Chlorella sp.NAt01培养液；图1d为Porphyridium cruentum CCMA-143培养液，其中，绿色荧光颗粒为细菌(图中箭头所指)，红色荧光颗粒为微藻细胞)，并于流式细胞仪检测培养液中细菌的数量。

根据检测出的细菌数量对各个微藻培养液用灭菌人工海水稀释100-10000倍，使得培养液中细菌浓度约为10⁴cells/mL。

分别吸取100μl稀释后的Porphyridium cruentum CCMA-143、Phaeodactylumtricornutum CCMA-267、Chlorella sp.CCMA-410、Chlorella sp.NAt01培养液，分别涂布于本发明固体培养基和2216E培养基上，每个处理三个重复，22℃培养箱培养21天。

培养结束后对各个平板上细菌菌落数总数计数，每个处理取平均值，经计算，得到本发明培养基得到的总菌落数为989个，2216E培养基长出的总菌落数为751个。

挑取各个固体培养基平板上形态差异菌落，对挑取的菌落分别在与分离培养基相同的固体平板上划线纯化两次，挑取纯化后的细菌单克隆菌落使用通用引物进行菌落PCR扩增16S rDNA基因片段，对所得16S rDNA基因片段测序，测序结果上传至NCBI，通过比对16S rDNA基因序列进行细菌菌种鉴定。

测序后结果显示本发明的培养基共分离得到24种细菌，其中9种为新种(图2，标“▲”为新种)，对照组2216E培养基共分离得到18种细菌，其中6种为新种(图3，标“▲”为新种)。本发明的培养基所分离的细菌种类丰度显著优于2216E培养基。

将分离纯化所得的微藻培养液共栖细菌菌液加入终浓度为25％的甘油冻存，重复上述步骤，建立待筛选藻际共栖细菌库。

实施例2

一种影响海洋微拟球藻(Nannochloropsis gaditana CCMP526)生长的关键细菌高通量快速筛选方法，具体包括以下步骤：

从实施例1中所建立的藻际细菌库中随机选取16株细菌，筛选对产油模式微藻—微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCMP526生长有关键影响的细菌，具体操作如下：

(1)确定微藻接种范围：将10⁹个细胞/ml的微拟球藻母液2倍梯度稀释直至10³个细胞/ml，通过流式细胞仪对不同浓度的微拟球藻细胞计数确认，同时利用酶标仪以激发光为488nm发射光为680nm检测各个浓度下藻细胞对应的叶绿素荧光值，每个浓度三个技术重复，建立微藻细胞数量与叶绿素荧光值线性关系标准曲线(图4)，获得藻细胞数量(cells)与酶标仪检测到的叶绿素荧光值(Fluorescence>4cells/mL作为微拟球藻N.gaditanaCCMP526接种初始浓度的下限及比上限值低一个数量级的藻细胞数量1.0×10⁸cells/mL作为微藻接种初始浓度上限值。

(2)确定细菌接种浓度范围：设置不同细菌浓度梯度，与藻液(藻液接种浓度1.0×10⁶cells/mL)混合后利用酶标以激发光为488nm发射光为680nm检测各个接种细菌浓度下藻液叶绿素荧光值，将对藻的叶绿素荧光值影响的细菌接种浓度作为细菌接种浓度的上限5×10⁹cells/mL。

因叶绿素荧光值稳定，荧光透射能力强，一般小于5×10⁹cells/mL以下浓度的细菌不会对藻液叶绿素荧光值产生显著干扰。

(3)将前述建立的待筛选微藻共栖细菌库中的16株纯培养菌株利用本发明中的液体培养基分别在三角瓶中摇床扩繁培养至对数生长后期(培养条件为150rpm，28℃)。离心收集菌体，所用离心力为3500g，时间为5min。然后用人工海水对收集的菌体离心清洗三次，所得菌体用f/2人工海水培养基再悬浮，制备成细菌接种母液待用。

本发明的液体培养基配制方法：蛋白胨2.5g,酵母提取物0.5g,柠檬酸铁0.005g，甲胺盐酸盐1g；人工海水1L，搅拌均匀后121℃，高压灭菌20分种。冷却至60℃左右时，添加f/2母液1ml/L。

(4)用f/2人工海水培养基将纯培养的微拟球藻N.gaditana CCMP526培养至对数生长期，离心收集藻细胞，所用离心力为3000g，时间为5min。然后用人工海水对收集的菌体离心清洗三次，所得菌体用f/2人工海水培养基再悬浮，制备成微藻接种母液待用。

(5)将步骤(3)所得细菌接种母液分别与步骤(4)所得微藻纯培养母液在96孔板(黑壁透明底有盖)中，设置微藻和细菌的接种浓度梯度共培养10天，培养条件为：22℃；光强为70μmol/m²/s¹；二氧化碳浓度(v/v)：2％。

共培养操作流程如图5所示，为防止藻菌细胞沉淀，在微孔中加入无菌玻璃珠，并每日轻微震动96孔板，将藻菌共培养物摇匀。

按照步骤(1)和步骤(2)得出的有效接种范围，96孔板的每列以10倍浓度梯度递增接种细菌，每行以10倍浓度梯度递增接种微藻，并设置纯培养藻液作为空白对照(如图5)。

(6)利用酶标仪以激发光为488nm发射光为680nm每2天检测一次96孔板各孔培养物的的微藻叶绿素荧光值FI。

(7)按照步骤(1)建立的微藻细胞数量与叶绿素荧光值线性关系标准曲线，将检测记录的叶绿素荧光值转换为对应的微藻细胞数量，计算每个独立微孔藻在共培养期间的生长速率，将接种各种细菌及各个菌浓度梯度的共培养微藻生长速率与纯培养微藻的最大生物量及生长速率进行对比，从而确定各种细菌对微藻生长影响——促进或抑制微藻生长，以及产生影响的细菌接种浓度。

从藻际细菌库中随机选取的16株细菌，筛选得到2株对产油模式微藻微拟球藻N.gaditana CCMP526生长有关键影响的细菌，其中一株为编号NAt01B11的菌株显著促进微拟球藻生长，另一株编号为NAt01B8的菌株显著抑制微拟球藻生长(图6)。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。