一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法

摘要

本发明属于水产生物技术领域，公开了一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法，基因组DNA使用限制性内切酶进行酶切；RAD测序结果经过过滤和质控后，将所有的雌性样本和雄性样本比对参考基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果；将获得scaffold按照雌性样本总reads比对数量进行排序，提取所有样本同时有reads覆盖的DNA区域，作为候选的雌性特有序列片段；根据雌性特有序列片段进行雌性基因组Walking，获得DNA片段；基于特异性片段设计的引物进行引物筛选和验证。本发明遗传性别鉴定的准确率高。

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，尤其涉及一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

中华鳖(Pelodiscus sinensis)，俗称甲鱼、水鱼、团鱼，属于爬行纲、龟鳖目。其分布范围广泛，在我国除了青海、西藏和新疆外均有分布。由于中华鳖具有较高的营养价值和药用价值，一直以来深受广大消费者的喜爱。中华鳖雄性个体生长速度快于雌性个体，雄性个体的裙边宽厚，苗种的价格也较雌性高，养殖全雄或高雄性中华鳖可提高养殖产量，增加经济效益。因此，中华鳖的性别控制研究业已成为中华鳖育种的研究热点。

目前在中华鳖的性别控制研究方面，有温度诱导和外源激素诱导等方法，这些方法均可获得一定比例的性逆转个体。准确鉴定性逆转个体，并进行深入研究对于中华鳖性别控制和全雄苗种培育具有重要的意义。

性别特异性分子标记是一种中华鳖遗传性别鉴定简便易行的工具。在鱼类上已经开发出一些性别特异的RAPD、SSR、AFLP和SNP等分子标记。随着测序技术的发展和费用的下降，利用基因组测序技术在鱼类性别特异性分子标记的开发方面也取得了一些良好的进展，获得了一些分子标记。为了筛查出性逆转个体，进而进行中华鳖性别控制技术研究，故发明一种可以用于中华鳖遗传性别鉴定的方法至关重要。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有常规技术主要通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，且在中华鳖规格较小或外形特征不明显时，无法进行准确鉴定，鉴定效果差。

如果未发生性逆转时，遗传性别与生理性别一致，但是如果是性逆转个体，遗传性别与生理性别不一致，无法通过生理性别的鉴定得到其遗传性别。

通常进行中华鳖性别控制研究中，中华鳖群体中同时存在未性逆转个体和性逆转个体，通过外形鉴定无法获得真正的遗传性别。

可以通过染色体鉴定的方法进行中华鳖遗传性别的鉴定，但是由于中华鳖没有特征明显的异型染色体，准确鉴定有一定的难度，同时染色体的鉴定耗时费力，成本较高。

解决上述技术问题的难度：

准确地进行中华鳖遗传性别的鉴定，可以通过开发准确高效的分子标记实现，目前虽然性别特异性标记开发的技术方法很多，一些技术手段也比较成熟，仅在技术方面而言不存在技术障碍，但是在实际分子标记开发过程中存在很大的不确定性，与研究人员使用的中华鳖群体、分子标记方法、研究过程中的分析方法、参数设置等方面都有密切的关系。

解决上述技术问题的意义：

性别特异性标记的开发，能实现早期对常规孵化苗种的遗传性别进行鉴定，从而进行单性苗种的培育和养殖，提高经济效益。在性别控制研究中，利用分子标记结合生理性别，准确鉴定出性逆转个体，对于开展中华鳖性别决定、性别诱导和性别控制技术研究，进行全雄(高雄)中华鳖选育具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法。

本发明是这样实现的，一种中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

收集中华鳖雌雄个体进行RAD测序，使用限制性内切酶EcoRI进行酶切；测序结果经过过滤和质控后，将所有的雌性样本和雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果；

将10个样本总比对reads大于100，且在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段；

根据雌性特有序列片段进行雌性基因组Walking，获得5967bp的DNA片段SEQ IDNO：1；

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

进一步，特异性引物为:

PSFF:GCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTG；

PSFR:CTTGAATGTGACTAGGAAGGCTTC。

本发明的另一目的在于提供一种中华鳖雌性性别特异性分子标记，为5967bp的DNA片段SEQ ID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

1)采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；

2)提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；

3)利用引物对PSFF/PSFR在中华鳖个体中进行扩增；

PSFF:GCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTG。

PSFR:CTTGAATGTGACTAGGAAGGCTTC。

4)扩增结果在1.5％-2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测；

5)进行遗传性别的鉴定。

进一步，步骤2)中，基因组DNA提取方法包括：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经剪碎后放入1.5mL的离心管中；

(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4～6h；

(3)加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；

(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，摇匀20min，再13000rpm离心10min；

(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min；

(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥；

(7)加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜；

(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。

进一步，步骤3)中，性别特异性标记的扩增方法包括：

94℃预变性5min，35-40个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

进一步，步骤4)中，性别特异性片段的电泳方法包括：

扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果分析。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的用于中华鳖遗传性别鉴定的雌性特异性分子标记和鉴定方法，方法简单易行，操作方便，鉴定成功率高。

本发明对于遗传性别的鉴定不受规格和外形特征的限制，能准确鉴定；而现有技术对于规格较小，或外形特征不明显的中华鳖个体，不能准确鉴定。中华鳖苗种的早期性别鉴定，可以极大地提高养殖产量，增加养殖效益。

本发明不论是对于是否发生性逆转的个体均能准确鉴定，而常规技术只能通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，在不发生性逆转时获得遗传性别，而无法鉴定性逆转个体。

本发明可以实现一次性大批量准确鉴定中华鳖的遗传性别。

本发明对于中华鳖性别决定、性别控制和全雄苗种培育具有重要的科研价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法流程图。

图2是本发明实施例提供的雌性特异性标记电泳结果图。

图3是本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记鉴定方法流程图。

图4是本发明实施例提供的遗传性别鉴定电泳结果图。

图中：M为DL2000marker，F1-F12为雄性个体，M1-M12为雌性个体。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术主要通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，不能进行遗传性别的鉴定。而且现有技术中，遗传性别鉴定的准确率低。

为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

S101:收集中华鳖雌雄个体各10只，进行RAD测序(Restriction-site AssociatedDNA Sequence)，使用限制性内切酶EcoRI进行酶切。

S102:测序结果经过过滤和质控后，将所有的10个雌性样本和10个雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果。

S103:将在10个雌性样本总比对reads大于100，同时满足在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段。

S104:根据雌性特有序列片段进行雌性基因组Walking，获得5967bp的DNA片段SEQID NO：1。

S105:基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物，电泳时在雌性个体中有特异性条带，在雄性中无条带。如图2。

如图3所示，本发明实施例提供的中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

S201:采集中华鳖裙边组织，将其保存在无水乙醇中，带回实验室。

S202:提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中。

S203:利用引物对PSFF/PSFR在中华鳖个体中进行扩增。

PSFF:GCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTG SEQ ID NO：2。

PSFR:CTTGAATGTGACTAGGAAGGCTTC SEQ ID NO：3。

S204:扩增结果在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

S205:进行遗传性别的鉴定。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例

本发明中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

1)、收集中华鳖雌雄个体各10只，进行RAD测序(Restriction-site AssociatedDNA Sequence)，使用限制性内切酶EcoRI进行酶切。

2)、测序结果经过过滤和质控后，将所有的10个雌性样本和10个雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果。

3)、将在10个雌性样本中总比对reads大于100，且在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段。

4)、根据雌性特有序列片段进行雌性基因组Walking，获得5967bp的DNA片段SEQID NO：1。

5)、基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物，电泳时在雌性个体中有特异性条带，在雄性中无条带。

其中，SEQ ID NO：1序列为：

CATGTAAGCATTACAGACTTGTTACCTCTCATTAGTGTTCCTGTGCATGACATCCCTTCCTGTTTAAATGCTGTGGCCAGCTTTAGAGAGGAAGTGGTGAGGGGGAGAGGCAGTAAGGCACTGTTGAAGTTCTTATTAGCTGTGCATATGAGCCACTGGTGAGGCTGAATTTGTGCTGAGTCAGCAGAGCACCTTCCTGTTTTCAGAATCCACAGTAGCACTTCAGCTCTGAGTTAATGAGCCTTGGTTCACAGGGCTGTGGAGGCTAATGCCAGCTAGATCTGAAAATCACAATGCCCAGCTATTAAAGGGGAATACCAGGAAATGAGACTGACTTTTTTGAGGACAGAAATAGCTGTAGAAGTCTGATGCAAAGTGTAAACCTTTTGCTTCTCCATCCACTCACAATTATTTAAAACTAAGAACTTTTGAGAATTGTAGCGGATGCTTTCTACATGAAGGTTTTTGGACTTCCTGATGCATATAATACTGCTGCAGTAACAGCTTCTCAGAGCACTGAGGACAGATTGGAAAAATGTGGGGGCTTGTTACTCCCCATATTGAAGATTAGCAGAGTAGATACCAGCAGTGTTCCTTCTAAACTGCAGGGCAGCACAGCTTCACAGGTGATTAATCAGCCCCACCCAGACAGTCAGCTCCATGTACGGAGCCTCTGACTGGGCAGGACTGATTAATCACCTGTGAAGCTGTGCTGTCACTCATCTTAGAGGGAACACTGATTACCAGCCTGCCCCAGAACCTTCCATGTACAAGCAATAAAAATTTCCAGCTTTGCATGCAACTGGAGGACATATTTGCTTTTAGCCCCTCTGGGACATTGATGGCAAAGACTTAAGGAAGAAATGAAAAAGCTGCTCCAACACCTTGTATTGTAGTAGAGCAATGGTTCAAACTTTTTGGCCTGTGGCCCATCCAGCTCAATGCAAACCTTTCTGCAGACTACCAGCTGCTGATGGAAATTTGCCGTTAATTATATAATTACGCCAGAGCCATTTTGCTAGTGCTGCAGCTAGGGAGAATGGTTTAATTTAACCAGTAAGAAAGGAAATATTAAGCAGATTATGTGCTTTAATTTCTCATGTTAGTTTACCAAACTTCATTTTAAATACTGTAAAATATTAATTTATGTTCAACACAAAAGGCTTCAACATTGTCTTTATGGCGGGGTGGGGAACCTTTTTTGGGTTGGGGCCACTGACCCACAGAAAAATCAGTTGGGGACCACACAAGCAAGAAGCAAAACCCTTCAAAAAGCCCCAGCCCTCACTGATGTGGTCCCCCAACTGAGACACCTCACTCCCCTGTTGCTCCAGCCTCCTCTGCAGTGGACCGTATTCCCTGTATAGATAATAAAACAACAAGATTGTGGAGTCAGAATTTTATTGTCAAGGGAGTGTCTGATTTGCTTAGACCAGGGGTGGGCAAAAGCCTGTCAGCGGGCCAGATCCAGCCTGCCTAGGGCTTTGTTCCGGCCCACACGGCAGTTCCAGGCCCCACCCTCTAGCACGTTGCCTGGGAGCCAGGGACTCGCAAGCCCTTTCAACTGCTTCCATTTAAAGTACTTGTGGCTGACGGGTAACAGCCCCAAGGAAGGTGCAAGCCCTTTAAATACAGGCAGTCCCCGGGTTACGTACAAGATAGGGACTGTAGGTTTGTTCTTAAGTTGAATTTGTATGTAAGTCGGAACTGGTACATATTGTAGGGGAAACTCGAGCCAAACATTTCTCCAGAGCTCAGTTTTATTCTCCCACACCTCACTTCCCTCAGTCCTTTATTCTCAAGCTGAAGTGTCTTCTGAGAAAAGCCGCTTCGCATCTCCTGGTCTGCTGAGAAGCCGCTCCGCGTCTCCCTAGTCTGCTGGGGGGAAGCAGCTAGTGCGGGGTTGCCTCACCCTGTTTGTAAGTAGGGATCCGATGTAAGTCGGATCCATGTAACCCGGGGACTGCCTGTAGAAGCAGTTGAAAGGGCTCTAGTGTTCCCTGCTTCCAGGCAATGCACAAGCAGTGAGGCTGGGAGCAGTGAGCCCTTTAAATAGCAGGAATTGAAAGGGCTGGCCGCTCTTGTCCCTCACTAACTGCCTGGGAGCTAAATGGGAGGTGCAAACCCTTTCAACTCCTGCCATTTAAAGCTCTGCCCCTTCTGTCTGAGGTCCTGCCCCTTCTGGGGTGGCCTGTGACCACTTCAAAAATTATTGCCCACCCCTGACTTAGACCAAGCCATTGGGTAGCTAATGAAATTACCTGGCTATAAAGGTTACAGAAGGGTATGGCCAAACAAAGCATGGGTAGGGTGCCAATACATGTCAACAGAACAGTTAAAATTGTAAGTTGTTCTAGCAGTGACTATTTGGATTGAGGTTAAAGATATAAAAAGGGGAAAAGGCGATCCTTGGCTATTGCTATAGACCAATACTACTACTTGCAGATAAAGATCGTCTATAGGTAGATGTCAGTCTGAGAGCATCTTGTTGTAATAATAGTGGGTTTGAAGTGCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTGCAATATGACTGAACTGAGTGGAATTCAGTAATAGAAAATGGGAAGCTGTAGTCAAGTCATCTCTGTATAGAAGCCTAACATACTTAAGTTATAGAAGCTGAATATGACTGTGATGGGGTGGCTAAGCCCCGCACTCCAGTGGCCCCGACCCTGGCTTTATACGGGGAAAGAGGGCTGCCGCACGGTGTCCCTGCTCAGCGAGGGGGGGCGGGGCTCGGAACAGTGGGTGCGCAATGCCCGGCGCTGGGGGGAGGGGTGGAGTGTGGGGTCACATGCAGATCGATGGGACATTTAAACCCCACGTCGGCGGGAAGGAAGGGGAGCTGGATGTGCCACGGAGGAGAGGAGGACAAGCAGTTCCACAGGCGGTCGGGAGGAGAGACTCCTCAGACCCACGGCCCCAACGTCCGAGACATCACCGGGTAGGAACAAGCAGGCGGTGTCGTCGAGTCCATCGGTTGTGAGGCGAGGGGGGGGGGGGGGTAGGAAGTGGCCCAGGGCAGGGCATTTCTATAGCCCGCGGGCTGGCGAGTTTCAGGAGGAGCCCCCTGCCAGCCGGACAGGGACACGATTGACCCTGCCCTTAGGGCCCTGGGCTGGGACTTGTGAGTGAGGGTGGGCCCGGGTCCCCCTACCCCCTCCCTCTACTGATTAAAAATTCTAATGTCTGGTGTGAGTGGAGGGGAGCTTCGGAAAGGGTAGGGCGTTGGGGCAGAGTGTTCATTTTGTGCGATTAGTAAATTGGCAATCCTATTTCCAGTAGGGGAACCCTACTTTGGTGGGCCTCTTGACAGCTGTCAAAAGGAGCTTTTCTCTTGTGAACCACCTCCTGGTTTTTTAAAATTATACCTATTACTTTAAAAGATTAGAAAGAAAAGAATGGAAGGGAGGGATTAACCTTTTCTTTGCTTTAATATATTTTTTCGTAGGAAAAATTTTTCGTTTACCTTTTGGTTGCTTTCCTGAACATTGGAACTGGACTTGAGGAACTTAATTTACAAAATGTTCCTAAATCCTTTTTTATGGTCCCTGTAAAATGTGTGATTTTGTTACTGCTCAAGAAAGATTCAAATGCTTTCCAGTTGATTCTCAGAATGGCCACGGCTATGTGTTTTTGTTTCTACTGATGGTGGACATTCACACATGTTTTGGGGCGTGTAAAAAAATATTTTGGAAAATTTTGTAAAAAAAGGAACCTTGGGCCCTGTCCCTGTGGTGTGAAGGGAACTAATGGGGATAAGAAAATATTCTTTAAAAAAAATATATTGTTGCGAAGATGTTTATTAACATCTTTCCTGATATAGCTTTTCTTGCTAAATTTCAAGCTTAACCGGTATAGTTTCAAAACCAAGAGCCGTCCCTTTTTATAAGAAAACTCCTGTTAGACTTTAGGCCCGAGACACCGAACAAGGGGGCTGCACCCTTTAACCCTGCTTGGGGGTATTTGGATGGTAGGGAATGCAAACTTTTTACGTTGACAAGATATACCTTCTGAGTCTCCCCTTCATTAAAACCCCTCTTCCATCATGTGCTTGCTCTGTCCCCCCCCCCTTAAAAAAAGAATAATGCGGTGACTGGACGAGGAGCCAGGGGGCGAAATGGACCCAGGGCGATGCAACACTTACCTATACATTTGGTGAAGATGGGCCCAGCAGATGACCCGGAAGCCTTCCTAGTCACATTCAAGAGAGTGGCCCGTTGGCCGGAAGATCGTTGAGCCACTCTTCTCGCCCCCTACCTGACTGGGCCAGTCCAGTAGTGAGGCACTGCACTATTACAAAGTCAAGGAAGTGATCCTGGACCAGATGGGGATAACCGTGGAAACTTACCGACAACGGTTCAGGCAGGAACAATACCCGCCCGGGGCAAGACCAAGGGCAGTAGTATAGAAACTCCGGGAGACAGGCTGGCGGTGGCTAGAACTAGATCAGCGGAGTGGGGCACAGGTTGCTGAACTCGTGGTGTTGGAACAATTCCTCCAGATTTTACCCAGTGGGGGACAACGGTGGGTGCGATGGCATCACCCATCCACTCTCTGAGGCAGTTGCCCTCATGGAAGACTACTTGATGGCCGAGTCAGCGGAAGGAGTAGGAAAGGGGGCCAGGGAAAATCCGGTGCCGAAAACTGCTTTAGAACGGTCAAGCCGCCCGAGAGACAGCAACGAGACTGGCTGGGCGAGGCCCCAAGGAAGAGGGAACAGCTGGAGACTGGCTCCAGTCTGGTCGGGGCCCGTTAGGGAAGCAAGGTCTGAGGAAACCCCCACCTCCCGAAGAGAAGGACCGGAACCCAGCGAGGGGTGGCCCGATCAAGAACACCTGTTTCAGGTGCAGCCAGGAGGGTCATCTTCAGGAGGAGTGTGTGATGGGATGAGGTCACAGGCGACCCCTCAGGGGTGCCTCCTGGGGTGCTGGCACGGCCACTGCCACTCGCCTTCCTGCTCTCTGGGGCTCCTCACCTCCCGGTCCTGCTGGGCCAGCTCCCTGGTCTCCCCCAGCCAAAGCCCTGACCTGAGGTCCCTGCCCCCACCGAGAAGCAGCACAGACACTGAACCTCCTCAGGTCCAAGGAGAGTGCAGTTTAGGGCCCAGCCTCCTGAGAGAGCACTCCCCAGATGGGATCAGACCCCAAAGAATTAGGTAAGCCCCCTTTAGCAATGGAAGGGGGAATGTGCACGCTGGTTGCCCCCCAGGTAACAATCGCTTACTCTGGGTTTGATAGAAAATAAAAATGGTTTTGTGAAGTGGAAGCAGTAGGATTTAAGTGGTAATAAGTGAAAGTAGGCAGAGCAAAGTAGGTCACAAATCAAAAGAAACAAAACCGCTTGGCTAATTCTACATTGAAACCTCAGTGCAAACTTAAACTCACCCTAAAAGCTCTTTTCCAGCTGCCACTCTAAATCAGGGCTGTCTTCCATGCCCTGGGGTCTCAGGCTCCTTCCTCCAGGTGCAACCCAGCCAAAAGCCCCAGGCCTCTCCTATTCTTTTTGTTAAAGAATTGAGGCCCCTCCCTACCAACTACTTCTCAGACTTAAAGACAAAAGATTGTTGAACAGTGGCTCATCTAGAAGTTGCAGTAACACCCTCCATGTCTCCCATTCATACATTTGAAACTCACCAAGTATTCCCCACTCCATGCGTCTAATTTTCCACATACAAATGATACATACAACAGAGTAAGATAAACAGAACCAACAGATTGACATGAAGATTGATGGGTTACATGAAATAATTTTCTCAAACCACCTTTGAGTTATGTATATTCAAGTCCGAGAGTCTATTTCATAAAGCAGGGGGGGTCCGTCACAGAGTGTCCTTACATGGACTGTACATTCGGGCAGGTATTATTGGCAGACGCAGACCAGAAGCTGCGGGAGGGATGGTGGATTGTCAAGGCAATTGAGGTGGAAGGGGTGCCAGTGATTGCTCTGGTTGA。

本发明实施例提供的中华鳖遗传性别的鉴定方法包括：

A)、待鉴定样本的收集：

根据中华鳖形态特征初步判断中华鳖的生理性别，雌性个体尾短，尾端不或很少自然伸出裙边外；雄性个体尾长，能够自然伸出裙边。采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为F，雄性记为M，带回实验室。

B)、基因组DNA提取：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中。

(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4～6h。

(3)加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min。

(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min。

(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min。

(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥。

(7)加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜。

(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。

C)、性别特异性标记的扩增：

(1)引物PSFF/PSFR信息

PSFF:GCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTG。

PSFR:CTTGAATGTGACTAGGAAGGCTTC。

(2)PCR反应体系:

(3)PCR反应过程:

94℃预变性5min，35-40个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

D)、性别特异性片段的电泳:扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在左边上样雌性个体(记为F1-F12)，右边上样雄性个体(记为M1-M12)，中间上样DL2000marker(记为M)，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。

E)、遗传性别的鉴定:

在1400bp左右有明显一条特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例

利用开发的雌性特异性分子标记快速批量进行中华鳖遗传性别的鉴定

A)待鉴定样本的收集：

随机收集3月龄的中华鳖个体，采用解剖的方法对其生理性别进行鉴定，选取其中雌性个体50个，记为F1-F50，雄性个体50个，记为M1-M50，并收集样本肌肉组织保存于无水乙醇中。

B)、基因组DNA提取：

采用基因组DNA试剂盒进行基因组DNA的提取，方法按照说明书进行，提取后DNA溶解于超纯水中保存于-20℃。

C)、性别特异性标记的扩增：

采用上游引物PSFF:GCTGCTGGGAAGACTTAGAGTTG，下游引物PSFR:CTTGAATGTGACTAGGAAGGCTTC的雌性特异性引物组进行PCR扩增。

PCR反应体系为10×PCR buffer mix 2.5μL，10μM上下游引物各0.5μL，5U/μl TaqDNA polymerase 0.5μL，100ng/μl DNA模版1μL，超纯水20μL，总体积为25μL。

PCR反应程序为94℃预变性5min，35个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

D)、性别特异性片段的电泳:扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。

E)、遗传性别的鉴定:

有明显的一条大小为1400bp左右特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。经鉴定，遗传性别与生理性别一致，雌雄个体均为50个，雌雄比例1:1。

如图4是本发明实施例提供的遗传性别鉴定电泳结果图。图中：M为DL2000marker，F1-F12为雄性个体，M1-M12为雌性个体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgtaagca ttacagactt gttacctctc attagtgttc ctgtgcatga catcccttcc 60

tgtttaaatg ctgtggccag ctttagagag gaagtggtga gggggagagg cagtaaggca 120

ctgttgaagt tcttattagc tgtgcatatg agccactggt gaggctgaat ttgtgctgag 180

tcagcagagc accttcctgt tttcagaatc cacagtagca cttcagctct gagttaatga 240

gccttggttc acagggctgt ggaggctaat gccagctaga tctgaaaatc acaatgccca 300

gctattaaag gggaatacca ggaaatgaga ctgacttttt tgaggacaga aatagctgta 360

gaagtctgat gcaaagtgta aaccttttgc ttctccatcc actcacaatt atttaaaact 420

aagaactttt gagaattgta gcggatgctt tctacatgaa ggtttttgga cttcctgatg 480

catataatac tgctgcagta acagcttctc agagcactga ggacagattg gaaaaatgtg 540

ggggcttgtt actccccata ttgaagatta gcagagtaga taccagcagt gttccttcta 600

aactgcaggg cagcacagct tcacaggtga ttaatcagcc ccacccagac agtcagctcc 660

atgtacggag cctctgactg ggcaggactg attaatcacc tgtgaagctg tgctgtcact 720

catcttagag ggaacactga ttaccagcct gccccagaac cttccatgta caagcaataa 780

aaatttccag ctttgcatgc aactggagga catatttgct tttagcccct ctgggacatt 840

gatggcaaag acttaaggaa gaaatgaaaa agctgctcca acaccttgta ttgtagtaga 900

gcaatggttc aaactttttg gcctgtggcc catccagctc aatgcaaacc tttctgcaga 960

ctaccagctg ctgatggaaa tttgccgtta attatataat tacgccagag ccattttgct 1020

agtgctgcag ctagggagaa tggtttaatt taaccagtaa gaaaggaaat attaagcaga 1080

ttatgtgctt taatttctca tgttagttta ccaaacttca ttttaaatac tgtaaaatat 1140

taatttatgt tcaacacaaa aggcttcaac attgtcttta tggcggggtg gggaaccttt 1200

tttgggttgg ggccactgac ccacagaaaa atcagttggg gaccacacaa gcaagaagca 1260

aaacccttca aaaagcccca gccctcactg atgtggtccc ccaactgaga cacctcactc 1320

ccctgttgct ccagcctcct ctgcagtgga ccgtattccc tgtatagata ataaaacaac 1380

aagattgtgg agtcagaatt ttattgtcaa gggagtgtct gatttgctta gaccaggggt 1440

gggcaaaagc ctgtcagcgg gccagatcca gcctgcctag ggctttgttc cggcccacac 1500

ggcagttcca ggccccaccc tctagcacgt tgcctgggag ccagggactc gcaagccctt 1560

tcaactgctt ccatttaaag tacttgtggc tgacgggtaa cagccccaag gaaggtgcaa 1620

gccctttaaa tacaggcagt ccccgggtta cgtacaagat agggactgta ggtttgttct 1680

taagttgaat ttgtatgtaa gtcggaactg gtacatattg taggggaaac tcgagccaaa 1740

catttctcca gagctcagtt ttattctccc acacctcact tccctcagtc ctttattctc 1800

aagctgaagt gtcttctgag aaaagccgct tcgcatctcc tggtctgctg agaagccgct 1860

ccgcgtctcc ctagtctgct ggggggaagc agctagtgcg gggttgcctc accctgtttg 1920

taagtaggga tccgatgtaa gtcggatcca tgtaacccgg ggactgcctg tagaagcagt 1980

tgaaagggct ctagtgttcc ctgcttccag gcaatgcaca agcagtgagg ctgggagcag 2040

tgagcccttt aaatagcagg aattgaaagg gctggccgct cttgtccctc actaactgcc 2100

tgggagctaa atgggaggtg caaacccttt caactcctgc catttaaagc tctgcccctt 2160

ctgtctgagg tcctgcccct tctggggtgg cctgtgacca cttcaaaaat tattgcccac 2220

ccctgactta gaccaagcca ttgggtagct aatgaaatta cctggctata aaggttacag 2280

aagggtatgg ccaaacaaag catgggtagg gtgccaatac atgtcaacag aacagttaaa 2340

attgtaagtt gttctagcag tgactatttg gattgaggtt aaagatataa aaaggggaaa 2400

aggcgatcct tggctattgc tatagaccaa tactactact tgcagataaa gatcgtctat 2460

aggtagatgt cagtctgaga gcatcttgtt gtaataatag tgggtttgaa gtgctgctgg 2520

gaagacttag agttgcaata tgactgaact gagtggaatt cagtaataga aaatgggaag 2580

ctgtagtcaa gtcatctctg tatagaagcc taacatactt aagttataga agctgaatat 2640

gactgtgatg gggtggctaa gccccgcact ccagtggccc cgaccctggc tttatacggg 2700

gaaagagggc tgccgcacgg tgtccctgct cagcgagggg gggcggggct cggaacagtg 2760

ggtgcgcaat gcccggcgct ggggggaggg gtggagtgtg gggtcacatg cagatcgatg 2820

ggacatttaa accccacgtc ggcgggaagg aaggggagct ggatgtgcca cggaggagag 2880

gaggacaagc agttccacag gcggtcggga ggagagactc ctcagaccca cggccccaac 2940

gtccgagaca tcaccgggta ggaacaagca ggcggtgtcg tcgagtccat cggttgtgag 3000

gcgagggggg ggggggggta ggaagtggcc cagggcaggg catttctata gcccgcgggc 3060

tggcgagttt caggaggagc cccctgccag ccggacaggg acacgattga ccctgccctt 3120

agggccctgg gctgggactt gtgagtgagg gtgggcccgg gtccccctac cccctccctc 3180

tactgattaa aaattctaat gtctggtgtg agtggagggg agcttcggaa agggtagggc 3240

gttggggcag agtgttcatt ttgtgcgatt agtaaattgg caatcctatt tccagtaggg 3300

gaaccctact ttggtgggcc tcttgacagc tgtcaaaagg agcttttctc ttgtgaacca 3360

cctcctggtt ttttaaaatt atacctatta ctttaaaaga ttagaaagaa aagaatggaa 3420

gggagggatt aaccttttct ttgctttaat atattttttc gtaggaaaaa tttttcgttt 3480

accttttggt tgctttcctg aacattggaa ctggacttga ggaacttaat ttacaaaatg 3540

ttcctaaatc cttttttatg gtccctgtaa aatgtgtgat tttgttactg ctcaagaaag 3600

attcaaatgc tttccagttg attctcagaa tggccacggc tatgtgtttt tgtttctact 3660

gatggtggac attcacacat gttttggggc gtgtaaaaaa atattttgga aaattttgta 3720

aaaaaaggaa ccttgggccc tgtccctgtg gtgtgaaggg aactaatggg gataagaaaa 3780

tattctttaa aaaaaatata ttgttgcgaa gatgtttatt aacatctttc ctgatatagc 3840

ttttcttgct aaatttcaag cttaaccggt atagtttcaa aaccaagagc cgtccctttt 3900

tataagaaaa ctcctgttag actttaggcc cgagacaccg aacaaggggg ctgcaccctt 3960

taaccctgct tgggggtatt tggatggtag ggaatgcaaa ctttttacgt tgacaagata 4020

taccttctga gtctcccctt cattaaaacc cctcttccat catgtgcttg ctctgtcccc 4080

ccccccttaa aaaaagaata atgcggtgac tggacgagga gccagggggc gaaatggacc 4140

cagggcgatg caacacttac ctatacattt ggtgaagatg ggcccagcag atgacccgga 4200

agccttccta gtcacattca agagagtggc ccgttggccg gaagatcgtt gagccactct 4260

tctcgccccc tacctgactg ggccagtcca gtagtgaggc actgcactat tacaaagtca 4320

aggaagtgat cctggaccag atggggataa ccgtggaaac ttaccgacaa cggttcaggc 4380

aggaacaata cccgcccggg gcaagaccaa gggcagtagt atagaaactc cgggagacag 4440

gctggcggtg gctagaacta gatcagcgga gtggggcaca ggttgctgaa ctcgtggtgt 4500

tggaacaatt cctccagatt ttacccagtg ggggacaacg gtgggtgcga tggcatcacc 4560

catccactct ctgaggcagt tgccctcatg gaagactact tgatggccga gtcagcggaa 4620

ggagtaggaa agggggccag ggaaaatccg gtgccgaaaa ctgctttaga acggtcaagc 4680

cgcccgagag acagcaacga gactggctgg gcgaggcccc aaggaagagg gaacagctgg 4740

agactggctc cagtctggtc ggggcccgtt agggaagcaa ggtctgagga aacccccacc 4800

tcccgaagag aaggaccgga acccagcgag gggtggcccg atcaagaaca cctgtttcag 4860

gtgcagccag gagggtcatc ttcaggagga gtgtgtgatg ggatgaggtc acaggcgacc 4920

cctcaggggt gcctcctggg gtgctggcac ggccactgcc actcgccttc ctgctctctg 4980

gggctcctca cctcccggtc ctgctgggcc agctccctgg tctcccccag ccaaagccct 5040

gacctgaggt ccctgccccc accgagaagc agcacagaca ctgaacctcc tcaggtccaa 5100

ggagagtgca gtttagggcc cagcctcctg agagagcact ccccagatgg gatcagaccc 5160

caaagaatta ggtaagcccc ctttagcaat ggaaggggga atgtgcacgc tggttgcccc 5220

ccaggtaaca atcgcttact ctgggtttga tagaaaataa aaatggtttt gtgaagtgga 5280

agcagtagga tttaagtggt aataagtgaa agtaggcaga gcaaagtagg tcacaaatca 5340

aaagaaacaa aaccgcttgg ctaattctac attgaaacct cagtgcaaac ttaaactcac 5400

cctaaaagct cttttccagc tgccactcta aatcagggct gtcttccatg ccctggggtc 5460

tcaggctcct tcctccaggt gcaacccagc caaaagcccc aggcctctcc tattcttttt 5520

gttaaagaat tgaggcccct ccctaccaac tacttctcag acttaaagac aaaagattgt 5580

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gaaactcacc aagtattccc cactccatgc gtctaatttt ccacatacaa atgatacata 5700

caacagagta agataaacag aaccaacaga ttgacatgaa gattgatggg ttacatgaaa 5760

taattttctc aaaccacctt tgagttatgt atattcaagt ccgagagtct atttcataaa 5820

gcaggggggg tccgtcacag agtgtcctta catggactgt acattcgggc aggtattatt 5880

ggcagacgca gaccagaagc tgcgggaggg atggtggatt gtcaaggcaa ttgaggtgga 5940

aggggtgcca gtgattgctc tggttga 5967

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgctggga agacttagag ttg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cttgaatgtg actaggaagg cttc 24