一种甘蔗白叶病植原体不同亚组的PCR-RFLP鉴别方法

摘要

本发明涉及一种甘蔗白叶病植原体不同亚组的PCR‑RFLP鉴别方法。以甘蔗白叶病植原体tuf基因为对象设计特异性引物，通过PCR扩增得到tuf基因片段，然后采用限制性核酸内切酶Msp I对扩增得到的tuf基因片段进行酶切，通过差异性的RFLP酶切图谱对甘蔗白叶病植原体进行不同亚组的区分。本发明无需测序即可快速、准确、高效的鉴别甘蔗白叶病植原体16SrXI‑B亚组和甘蔗白叶病植原体16SrXI‑D亚组，对甘蔗白叶病的病原鉴定和防控具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的PCR-RFLP鉴别方法。

背景技术

甘蔗白叶病是由植原体引起的甘蔗毁灭性病害，可造成甘蔗和制糖产业巨大的经济损失。该病于1954年首次在泰国发现，现已广泛发生于印度、巴基斯坦、斯里兰卡、老挝、缅甸、越南、菲律宾和澳大利亚等植蔗国家。2012年我国云南保山蔗区首次检测发现甘蔗白叶病植原体，之后甘蔗白叶病在云南蔗区迅速扩散蔓延，现已扩展到临沧、普洱蔗区，对云南蔗糖产业产生了严重威胁。先前对病原的多样性研究表明引起甘蔗白叶病的植原体可以分为2个亚组，即16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组，其中16SrXI-D亚组为新发现的亚组。云南临沧蔗区和保山蔗区发现的甘蔗白叶病植原体分别属于16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组。

目前，16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的区分是通过使用植原体16S rRNA基因设计的通用引物(P1/P7和R16F2n/R16R2)进行巢式PCR，然后对巢式PCR测序进行虚拟RFLP酶切分析来鉴定，该方法需要对产物进行测序分析，费时费力，另外，测序过程中产生的错误对虚拟RFLP酶切分析结果的准确性也会产生影响。目前还尚未建立使用实际酶切进行植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组鉴定的方法。建立一种快速、灵敏、准确的区分甘蔗白叶病植原体不同亚组的方法对甘蔗白叶病的病原鉴定和防控具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术缺乏简便、快速地鉴别甘蔗白叶病植原体不同亚组的技术问题，本发明提供一种快速、准确、简便的鉴别甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的方法。

本发明采取的技术方案为：

一种甘蔗白叶病植原体不同亚组的PCR-RFLP鉴别方法，包括下述步骤：

(1)以待鉴别甘蔗材料的基因组DNA为模板，采用tuf基因特异性引物进行PCR扩增，所述tuf基因特异性引物由tuf-F引物和tuf-R引物组成，tuf-F引物的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，tuf-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)使用限制性核酸内切酶Msp I对步骤(1)的PCR扩增产物酶切；

(3)结果判别，取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，酶切电泳图谱显示被Msp I酶切为两条带，一条为124bp，另一条为344bp的待鉴别甘蔗材料病原为甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组；没有被酶切的，即只有1条468bp大小条带的待鉴别甘蔗材料病原为甘蔗白叶病植原体16SrXI-D亚组。

进一步，步骤(1)中所述的PCR扩增的反应条件为：25μL PCR反应体系，其中，灭菌ddH₂O>2>

进一步，步骤(2)中的切酶反应条件为：25μL酶切反应体系，其中，PCR产物15μL，灭菌ddH₂O>

进一步，步骤(3)中取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳为取10μL酶切产物用3％琼脂糖凝胶进行电泳。

本发明还提供一种基于PCR-RFLP方法鉴别甘蔗白叶病植原体不同亚组的试剂盒，该试剂盒含有tuf基因特异性引物、限制性核酸内切酶Msp I或其同裂酶，所述tuf基因特异性引物由tuf-F引物和tuf-R引物组成，tuf-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供上述一种基于PCR-RFLP方法鉴别甘蔗白叶病植原体不同亚组的试剂盒在鉴别甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和/或甘蔗白叶病植原体16SrXI-D亚组中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的本发明人在前期研究获得的甘蔗白叶病植原体的tuf基因序列的基础上，设计特异性引物，扩增tuf基因片段大小为468bp，在此基础上，首次建立了一种简便、快速、准确、高效的鉴别甘蔗白叶病植原体不同亚组的方法。

现有技术确定甘蔗白叶病植原体不同亚组分类的方法是对16S rRNA基因的巢式PCR产物进行虚拟RFLP酶切分析来确定，实际的RFLP酶切鉴别方法尚未建立。以之相比，本发明基于不同的基因(tuf基因)，建立了一种实际的RFLP酶切鉴别方法来区分甘蔗白叶病植原体不同亚组，根据PCR扩增产物的酶切反应带型即可简便、快速、准确、高效的判断甘蔗白叶病植原体亚组的类型，不需要进行测序分析，节约了时间，降低了成本，提高了鉴别的准确性。

本发明方法对甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的快速、简便、准确的鉴别，对甘蔗白叶病的病原鉴定和防控具有重要意义，为研究甘蔗白叶病植原体不同亚组的致病力、流行规律及其防控提供了技术支持。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是tuf-F引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是tuf-R引物的核苷酸序列。

附图说明

图1为甘蔗白叶病植原体tuf基因PCR电泳图，其中，M为DNAMarker E，1为感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组的甘蔗叶片样品，显示一条条带；2为感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-D亚组的甘蔗叶片样品，显示一条条带；3为健康甘蔗叶片样品，4为ddH₂O。

图2为采用本发明方法的酶切电泳图，其中，M为DNAMarker E，1为感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组的甘蔗叶片样品，显示两条条带；2为感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-D亚组的甘蔗叶片样品，显示一条条带。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。

1.总DNA提取

按文献“Zhang R Y,Li W F,Huang Y K,et al.Group 16SrXI phytoplasmastrains,including subgroup 16SrXI-B and a new subgroup,16SrXI-D,areassociated with sugar cane white leaf.International journal of systematic andevolutionary microbiology,2016,66(1):487-491.”方法检测得到感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的甘蔗叶片，分别取感染了甘蔗白叶病植原体16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组的甘蔗叶片各0.2g，使用植物基因组DNA提取试剂盒(以北京全式金生物技术公司的Easy Pure plant Genomic DNAKit植物DNA提取试剂盒为例)分别提取叶片总DNA，具体步骤按照该说明书操作。

2.PCR扩增

使用甘蔗白叶病植原体tuf基因特异性引物：tuf-F引物/tuf-R引物分别对提取的总DNA进行PCR扩增，25μL PCR反应体系中加入灭菌双蒸水(ddH₂O)15.3μL，10×PCR缓冲液2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)2.0μL，dNTPs(10mmol/L)2.0μL，tuf-F引物(20μmol/L)1.0μL，tuf-R引物(20μmol/L)1.0μL，Taq>

3.RFLP分析

PCR反应结束后，取15μL PCR产物进行酶切反应。25μL酶切反应体系中加入PCR产物15μL，灭菌双蒸水(ddH₂O)7.5μL，10×buffer缓冲液1.5μL，限制性核酸内切酶Msp>

序列表

<110> 云南省农业科学院甘蔗研究所

<120> 一种甘蔗白叶病植原体不同亚组的PCR-RFLP鉴别方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaacagaaa aaagacatta tgctca 26

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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