一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器及其制备方法

摘要

本发明属电化学电极材料制备技术领域，提供一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的电化学传感器，同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤。基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯复合材料，并用其修饰玻碳电极表面制备而成，高的灵敏度和选择性，电极修饰过程更加简便，有良好的稳定性和重现性。基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的复合材料，水热法制备氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B‑rGO，制备铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B‑rGO；制备电极。提高了电极的灵敏度且使电极修饰过程更简单。电化学传感器用于构建同时检测腺苷中鸟嘌呤和腺嘌呤的传感体系，显著提高电极的选择性。

说明书

技术领域

本发明属于电化学电极材料制备技术领域，具体涉及一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器及其制备方法，该电化学传感器基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的电化学传感器，该传感器用于同时检测人体血清中嘌呤和腺嘌呤。

背景技术

鸟嘌呤（G）和腺嘌呤（A）是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）中的重要嘌呤碱基。它们对抑制神经递质释放，冠状动脉和脑循环，维持心律和控制血流有重要作用。生理液体中G和A的存在可能是由于组织降解或饮食摄取导致的核酸代谢或其他代谢机制中的酶功能失调造成的。生物体中嘌呤碱基的异常变化暗示着免疫系统的缺陷和突变，并可能暗示某些疾病的出现，如HIV感染、癫痫和癌症。此外，其浓度水平可为癌症、艾滋病、心肌细胞能量状态、疾病进展和治疗反应的诊断提供依据。因此，鸟嘌呤和腺嘌呤的测定对于深入了解遗传信息的基本机制具有十分重要的意义。

已报道的检测G和A的分析方法包括液相色谱法、量热法、毛细管区带电泳法和质谱法。然而，它们大多数都存在消耗大量有机试剂、设备昂贵、程序费时等缺点。与其他测定方法相比，电化学方法由于其成本低，灵敏度高，选择性好以及小体积样品易于小型化而被广泛使用。然而，由于G和A的氧化电位较高，电化学响应较弱，现有的电化学传感器难以实现对其的同时灵敏分析和稳定检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，该电化学传感器是基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的电化学传感器，该电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤。电化学传感器是基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）复合材料，并用其修饰玻碳电极表面制备而成，具有高的灵敏度和选择性，电极修饰过程更加简便，且具有良好的稳定性和重现性。

本发明由如下技术方案实现的：一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的复合材料，所述电化学传感器的制备方法为：

(1)水热法制备氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO：10 mg石墨烯GO与20ml水混合，40KHz超声10 min～30 min，将GO分散在水中，形成浓度为0.5 mg/mL的均匀GO悬浮液，加入摩尔分数为5%-10%的稀氨水，将悬浮液pH调节至8.0，在剧烈搅拌下向悬浮液中加入1.0g尿素和50.0 mg硼酸；将混合物在室温下搅拌30分钟，120℃下转移到Teflon衬里的反应釜中12小时，然后空气中冷却，12000 rpm离心收集N,B-rGO复合物并用水和乙醇反复洗涤，60℃下真空干燥，得到N,B-rGO复合物；

（2）制备铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO：在水中加入1.0 mg/mL～2.0 mg/mL氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO，40 KHz超声10 min～15 min使其形成分散液，加入160 mg的葡萄糖在室温下搅拌30分钟；然后滴加1.0mL质量浓度为1.0%的 NiNO₃金属前体溶液，并将混合物煮沸15～30>4金属前体溶液,将混合物煮沸15～30>

（3）电极的制备：将2.0 mg铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO复合物分散于2 mL二次水中，在40 KHz频率下超声10 min～30 min，制成浓度为1.0 mg/mL的分散液；将分散液滴涂到玻碳电极上，滴涂量为6.0μL～10.0μL；在红外灯下干燥5 min～30min，最后用二次水冲洗除去松散吸附的复合材料，得到铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO修饰电极。

优选：步骤（1）中稀氨水的摩尔分数为5%。步骤（2）中氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO的浓度为2.0 mg/mL。步骤（2）中超声时间为15 min；混合物煮沸时间为30 min。步骤（3）中超声时间为30 min；分散液滴涂到玻碳电极表面的量10.0μL；在红外灯下干燥20min。

所制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO修饰电极用于鸟嘌呤和腺嘌呤的同时检测，具体步骤为：先配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，浓度为0.01和0.1 M的磷酸盐缓冲溶液，进而配制含有鸟嘌呤和腺嘌呤的磷酸缓冲液，含有鸟嘌呤和腺嘌呤的磷酸缓冲液中：鸟嘌呤浓度为 0.30～190.0μM 、腺嘌呤浓度为50.0μM 、PBS 缓冲液浓度为 0.01 M 、pH＝3.0； 采用三电极体系，以铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO修饰电极为工作电极，氯化银电极为参比电极，铂丝为对电极，通过电化学工作站，检测电流对鸟嘌呤和腺嘌呤浓度的响应。

优选磷酸盐缓冲溶液的pH值为3.0，浓度为0.01 M。

石墨烯由于其独特的结构和优异的性能，如大的表面积、优良的导电性、易于官能化和生产，为电子器件和传感器提供了理想的基底。氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（N,B-rGO）可以通过形成具有氮，硼原子孤电子对的sp²杂化碳骨架的离域共轭体系，进一步提高石墨烯的反应性和电催化性能。此外，N,B-rGO为非共价官能化提供了丰富的结合位点以及生物传感应用中增强的生物相容性和灵敏度。氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（N,B-rGO）与铜@镍（Cu@Ni）两者的结合发挥了两者的协同作用，有助于传感器的导电性以及电子转移能力，改善了对鸟嘌呤和腺嘌呤的催化作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）复合材料，将其修饰在玻碳电极表面，提高了电极的灵敏度且使电极修饰过程更加简单。制得的电化学传感器，将其用于构建同时检测腺苷中鸟嘌呤和腺嘌呤的传感体系，可以显著提高电极的选择性。

本发明制备得到的电化学传感器可同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤。制得的电化学传感器，具有良好的稳定性和重现性，是铜@镍（Cu@Ni）独特性质的开发和应用，也为未来鸟嘌呤和腺嘌呤的检测提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明制备电化学传感器的修饰过程。图2为本发明制备电化学传感器用透射电镜表征氮、硼掺杂还原氧化石墨烯。图3为本发明制备电化学传感器铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯透射电镜表征图像。图4为本发明制备电化学传感器用循环伏安法表征电极修饰过程。图5为本发明制备电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的循环伏安图。图6为本发明制备电化学传感器在鸟嘌呤和腺嘌呤溶液中鸟嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图。图7为本发明制备电化学传感器鸟嘌呤浓度与峰电流的线性关系。图8为本发明制备电化学传感器在鸟嘌呤和腺嘌呤溶液中腺嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图。图9为本发明制备电化学传感器腺嘌呤浓度与峰电流的线性关系。图10为本发明制备电化学传感器在鸟嘌呤和腺嘌呤溶液随浓度变化的差分脉冲伏安图。图11为本发明制备电化学传感器鸟嘌呤浓度与峰电流的线性关系。图12为本发明制备电化学传感器腺嘌呤浓度与峰电流的线性关系。

具体实施方式

本发明是基于氮、硼掺杂还原氧化石墨烯复合材料，并用以修饰玻碳电极表面，制备一种电化学传感器，并用于同时检测人体血清中嘌呤和腺嘌呤。下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的复合材料，所述电化学传感器的制备方法为：

(1)水热法制备氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO：10 mg的石墨烯GO与20ml水混合，40KHz超声处理10 min～30 min，将GO分散在水中，形成浓度为0.5 mg/mL的均匀GO悬浮液，加入摩尔分数为5%的稀氨水，将悬浮液pH调节至8.0，在剧烈搅拌下向悬浮液中加入1.0g尿素和50.0 mg硼酸；将混合物在室温下搅拌30分钟，120℃下转移到Teflon衬里的反应釜中12小时，然后空气中冷却，12000 rpm离心收集N,B-rGO复合物并用水和乙醇反复洗涤，60℃下真空干燥，得到N,B-rGO复合物；

（2）制备铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO：在水中加入2.0 mg/mL氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO，40 KHz超声15 min使其形成分散液，加入160 mg的葡萄糖在室温下搅拌30分钟；然后滴加1.0mL质量浓度为1.0%的 NiNO₃金属前体溶液，并将混合物煮沸30>4金属前体溶液,将混合物煮沸30min；最后将冷却的分散溶液在7000rpm下离心30分钟，分离出未吸附的悬浮金属纳米颗粒；在45℃下真空干燥，得到铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）复合物；

（3）电极的制备：将2.0 mg铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO复合物分散于2 mL二次水中，在40 KHz频率下超声30 min，制成浓度为1.0 mg/mL的分散液；将分散液滴涂到玻碳电极上，滴涂量为10.0μL；在红外灯下干燥20 min，最后用二次水冲洗除去松散吸附的复合材料，得到铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯Cu@Ni/N,B-rGO修饰电极。制备的电化学传感器修饰过程示意图见图1。

对所制备的氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（N,B-rGO）使用透射电镜进行观察。如图2所示，投射电镜图片中，可以清楚地看到氮、硼掺杂还原氧化石墨烯是薄纱状的起皱纳米片。

对实施例1制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）修饰电极表面进行透射电镜表征。如图3所示，从图中可以看到，铜@镍通过还原负载在氮、硼掺杂还原氧化石墨烯表面，可以使传感器的灵敏度有很大的提高。说明本发明制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯修饰电极成功。

实施例2：所制备的电化学传感器修饰过程表征

取实施例1制备的修饰电极，在0.01 M pH=7.0的磷酸缓冲（PBS）溶液中以5.0 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-作为探针利用循环伏安法表征电极的修饰过程。如图4所示：修饰了氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（N,B-rGO）后电极产生的峰电流略微上升，这是因其具有良好导电性。在修饰了镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Ni/N,B-rGO）之后，由于电极表面电子转移效率加快，使得峰电流明显提高。在修饰了铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）之后，由于峰电流进一步明显提高。图4说明了实施例1中制备的电极修饰过程都是成功的。

实施例3：实施例1制备的电化学传感器同时进行鸟嘌呤和腺嘌呤的检测

取实施例1制备的不同修饰电极（裸电极，氮、硼掺杂还原氧化石墨烯，镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯和铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯），对待测定的两种碱基混合液进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤的循环伏安图。在铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯修饰电极后，电流信号明显增强，传感器的灵敏度有很大的提高。图5说明了实施例1中制备的电极修饰过程都是成功的，而且可以同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤。

实施例4：实施例1制备的电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的检测范围

对待测定的两种碱基混合液采用实施例1制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图。然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立两种 DNA 碱基电化学信号变化规律图（图6）。所述的两种碱基混合溶液由浓度为 0.30～190.0μM 的鸟嘌呤、浓度为50.0μM 的腺嘌呤和 pH＝3.0、浓度为 0.01 M 的 PBS 缓冲液混合后制成。此外，本发明制备的电化学传感器的电流变化与鸟嘌呤浓度呈良好的线性关系，如图7所示，在浓度为0.30～190.0μM范围内，线性方程为I_p(μA)＝0.0352C+8.637，R²＝0.9921和I_p(μA)＝0.233C+4.534，R²＝0.9904。

对待测定的两种碱基混合液采用实施例1制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）修饰电极进行电化学检测，得到腺嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图。然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立两种 DNA 碱基电化学信号变化规律图（图8）。所述的两种碱基混合溶液由浓度为 50.0μM 的鸟嘌呤、浓度为0.50～160.0μM 的腺嘌呤和 pH＝3.0、浓度为 0.01 M 的 PBS缓冲液混合后制成。此外，本发明制备的电化学传感器的电流变化与腺嘌呤浓度呈良好的线性关系，如图9所示，在浓度为0.50～160.0μM范围内，线性方程为I_p(μA)＝0.168C+4.826，R²＝0.9975和I_p(μA)＝0.052C+8.349，R²＝0.9936。

实施例5：实施例1制备的电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤

对待测定的两种碱基混合液采用实施例1制备的铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯（Cu@Ni/N,B-rGO）修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图。然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立两种 DNA碱基电化学信号变化规律图（图10）。所述的两种碱基混合溶液由浓度为 1.0～120.0μM 的鸟嘌呤、浓度为 1.0～160.0μM 的腺嘌呤和 pH＝3.0、浓度为 0.01 M 的 PBS 缓冲液混合后制成。此外，本发明制备的电化学传感器的电流变化与鸟嘌呤（图11）和腺嘌呤（图12）浓度呈良好的线性关系。如图11所示，在浓度为1.0～120.0μM范围内，线性方程为I_p(μA)＝0.0678C+5.027，R²＝0.9900和I_p(μA)＝0.1605C+3.493，R²＝0.9910。如图12所示，在浓度为1.0～160.0μM范围内，线性方程为I_p(μA)＝0.0491C+6.422，R²＝0.9930和I_p(μA)＝0.146C+4.862，R²＝0.9920。

实施例6：一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的复合材料，所述电化学传感器的制备方法为：步骤（1）中稀氨水的摩尔分数为8%；步骤（2）中氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO的浓度为1.5 mg/mL；步骤（2）中超声时间为12 min；混合物煮沸时间为20 min；步骤（3）中超声时间为20 min；分散液滴涂到玻碳电极表面的量8.0μL；在红外灯下干燥30 min。其余制备方法同实施例1所述方法。

实施例7：一种同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学传感器，基于铜@镍/氮、硼掺杂还原氧化石墨烯的复合材料，所述电化学传感器的制备方法为：步骤（1）中稀氨水的摩尔分数为10%；步骤（2）中氮、硼掺杂还原氧化石墨烯N,B-rGO的浓度为1.0 mg/mL；步骤（2）中超声时间为10 min；混合物煮沸时间为15 min；步骤（3）中超声时间为10 min；分散液滴涂到玻碳电极表面的量6.0μL；在红外灯下干燥5 min。其余制备方法同实施例1所述方法。

实施例8：实施例1制备的电化学传感器在人体血清中鸟嘌呤和腺嘌呤检测应用的实验

采用标准加入法用于实施例1制备的电化学传感器在血清中鸟嘌呤和腺嘌呤检测应用的实验。如表1所示，将谷胱甘肽标准溶液加入到稀释了10倍的人体血清中，用传感器进行定量检测，回收率为90％-110％，说明实施例1制备的电化学传感器可以用于人体血清中鸟嘌呤和腺嘌呤的测定。