一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法。该方法采用液相色谱分析技术，借助一测多评方法，能以芍药苷单一对照品对白芍提取液中的11种指标成分同时进行含量测定。该方法准确性好，能以较低成本对白芍提取液的质量进行评价，可解决因待测成分对照品缺乏而无法进行含量测定的问题，有助于更全面地对白芍及其相关中药制剂进行质量评价与控制。

说明书

技术领域

本发明属于中药成分含量测定领域，具体涉及一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法。

背景技术

白芍由毛茛科植物芍药（Paeonia> Pall.）的干燥根置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干而得。白芍是临床广泛使用的中药，具有药养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效。现代药理研究表明，白芍在抗炎、镇痛、神经系统保护、保肝等方面具有良好的药效。白芍是中药处方中的常见药味，许多中成药生产过程中都需要对白芍进行提取。建立白芍提取液的质量分析方法有助于白芍及其相关中药制剂的质量评价与控制。

2015版《中国药典》仅以芍药苷为指标成分对白芍进行含量测定。公开号为CN102138985B的中国专利文献公开了一种白芍制剂中芍药苷和芍药内酯苷的含量测定方法以及指纹图谱分析方法。指纹图谱分析虽然能以半定量的方式进行质量评价，但不能对各指标成分的含量进行准确测定。公开号为CN102495143A的中国专利文献公开了一种测定白芍中芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷亚硫酸酯3种化合物的方法。公开号为CN102297918A的中国专利文献公开了一种白芍及其炮制品中9种化合物（没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、丹皮酚）同时测定的方法。公开号为CN106841450A的中国专利文献公开了一种同时测定芍药中9种化合物（芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、五没食子酰葡萄糖）的方法。此外，也有多篇学术论文报道了白芍中上述成分及没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、苯甲酰芍药苷亚硫酸酯等成分的含量测定方法。然而，上述方法在应用时都需要使用待测成分的对照品，而一些成分对照品紧缺、价格昂贵，待测成分越多分析成本越高。

一测多评法是一种基于待测成分间的相对校正因子，以一个内参物对照品代替多个成分对照品进行定量的方法，可用于解决对照品紧缺和检测成本高的问题，是一种符合中药特点的多指标质量评价新模式。现有学术论文（一测多评法测定白芍中5种成分含量，中药材，39(8):1810-1813；一测多评法测定白芍中的五种成分含量，皖西学院学报，34(5):85-88）报道的白芍一测多评方法仅能同时测定5种成分，因此，为了以较低的分析成本测定更多成分，以更全面地评价白芍及相关中成药的质量，很有必要在现有技术基础之上研究设计出测定白芍提取液中多指标成分含量的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，基于一测多评法，提供一种能够准确测定白芍提取液中没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的简称）、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚11种成分含量的高效液相色谱分析方法。该方法操作简便、实用性高、检测成本低，可以客观、全面、准确地评价白芍提取液的质量，解决因对照品缺乏而无法准确测定多种指标成分含量的问题。

为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备

直接将白芍提取液作为供试品溶液进行分析；

（2）对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚11种成分的对照品适量，分别用体积分数为30~100%的甲醇水溶液溶解并定容，制成具有已知浓度的各指标成分的单一对照品储备液；

再分别精密吸取各成分的单一对照品储备液适量，混合后加体积分数为10~50%的甲醇水溶液稀释得到适宜浓度的混合对照品溶液，备用；

（3）相对校正因子的测定

取步骤（2）制备的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，得到混合对照品溶液中芍药苷和其他各待测成分的峰面积，以芍药苷为内参物，以相对校正因子计算公式f_x/s>=>f_x>/f_s>=>m_x>A_s) />m_s> A_x)分别计算没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚10种成分对芍药苷的相对校正因子，

式中，f_s为芍药苷的校正因子，f_x为除芍药苷以外的某一待测成分的校正因子，m_s是混合对照品溶液中芍药苷的进样质量，A_s是混合对照品溶液中芍药苷进样质量为m_s时测得的峰面积，m_x是混合对照品溶液中除芍药苷以外的某一待测成分的进样质量，A_x是混合对照品溶液中除芍药苷以外的某一待测成分进样质量为m_x时测得的峰面积；

（4）样品中多指标成分的测定

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到供试品溶液中各待测成分的峰面积，供试品溶液中芍药苷的进样质量m_s’由芍药苷单一对照品溶液以外标定量法测定得到，供试品溶液中除芍药苷以外的其他某一待测成分的进样质量m_x’由公式m_x’=>f_x/s×m_s>A_x ’/>A_s’)计算得到，

式中，A_s’和A_x’分别是供试品溶液中测得的芍药苷和除芍药苷以外的其他某一待测成分的峰面积，f_x/s是步骤（3）测得的没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚10种成分对芍药苷的相对校正因子；

供试品溶液中各待测成分的浓度由测定或计算得到的进样质量m_s’和m_x’经换算得到。

由于羟基芍药苷、没食子酰基芍药苷等成分的对照品价格昂贵，若采用常规的多个对照品外标定量测定方法，分析成本太高，本方法基于一测多评法，能准确且低成本地测定多个成分的含量。

所述测定方法中，高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：反相C₁₈色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为磷酸水溶液；洗脱程序为线性梯度洗脱；流速：0.9～1.1>

作为优选，所述的流动相中，磷酸水溶液的质量分数为0.005～0.02%。

作为优选，所述的洗脱程序中，乙腈占流动相体积比为：0～20 min，7～9%；20～50min，从7～9%线性增加到23～25%；50～60 min，49～51%；60～68 min，从49～51%线性增加到85～95%。

作为优选，步骤（3）中，没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚10种成分与芍药苷间的相对校正因子分别为0.0349 ± 0.003、0.0615 ± 0.006、0.149 ± 0.01、1.08 ±0.05、0.0328 ± 0.003、0.101 ± 0.01、0.0417 ± 0.004、0.190 ± 0.01、0.607 ±0.03、0.0202 ± 0.002。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供一种能够准确测定白芍提取液中11种成分含量的高效液相色谱分析方法，可以更全面、准确地评价白芍提取液的质量。

（2）本发明对流动相的组成、流动相流速、柱温进行了大量筛选，确定采用优选的色谱条件，可以同时保证11个指标成分在色谱分析中达到很好的分离。本发明通过紫外全波长扫描，综合考虑多波长测定的简便性，确定11个指标成分合适的检测波长，可以灵敏地检测各指标成分。

（3）本发明基于一测多评法，利用待测成分间的相对校正因子，以芍药苷单一对照品作为内参物代替多个成分对照品进行定量，可用于解决对照品紧缺和检测成本高的问题。本方法检测成本低、实用性高，具有很好的应用前景和使用价值。

（4）对本发明提供的分析方法进行方法学验证表明，该方法精密度、重复性、准确性、灵敏度均很好。本发明的测定结果通过外标定量法进行验证，结果表明，本发明的测定结果与外标定量法相似度极高，可以准确地测定各指标成分。

附图说明

图1为实施例1中混合对照品的高效液相色谱图；

图2为实施例1中白芍提取液的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法，该方法包括以下步骤：

（1）白芍提取液的制备

白芍药材（产地为吉林白山）粉碎、过筛至20~80目，取5 g粉末，加入25 mL容量瓶，加体积分数为70%的乙醇水溶液25 mL超声提取（超声功率500W，40kHz）40 min，提取结束，溶液放冷至常温后，定容至刻度线，即得白芍提取液。

（2）供试品溶液的制备

直接将步骤（1）得到的白芍提取液作为供试品溶液，无前处理和稀释。

（3）对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品，分别加体积分数30%的甲醇水溶液溶解并定容，制成4.975 mg/mL 没食子酸、2.974 mg/mL 羟基芍药苷、0.7321 mg/mL儿茶素、7.051 mg/mL芍药内酯苷、95.95 mg/mL芍药苷、12.62 mg/mL没食子酸乙酯、0.2959mg/mL没食子酰基芍药苷、3.838 mg/mL五没食子酰葡萄糖、3.727 mg/mL 苯甲酰芍药苷单一对照品储备液；精密称取苯甲酸、丹皮酚对照品，分别加纯甲醇溶解并定容，制成23.69mg/mL苯甲酸、4.009 mg/mL丹皮酚单一对照品储备液。

然后分别精密吸取上述各成分的单一对照品储备液，混合后加体积分数30%的甲醇水溶液稀释得到含42.29 μg/mL没食子酸、108.5 μg/mL 羟基芍药苷、56.74 μg/mL儿茶素、409.0 μg/mL芍药内酯苷、6141 μg/mL芍药苷、107.3 μg/mL没食子酸乙酯、136.0 μg/mL没食子酰基芍药苷、343.5 μg/mL五没食子酰葡萄糖、236.9 μg/mL苯甲酸、240.4 μg/mL 苯甲酰芍药苷、36.08 μg/mL丹皮酚的混合对照品溶液，于4℃保存，备用。

（4）相对校正因子的测定

以芍药苷为内参物（以符号s表示），m_s是其进样质量，A_s是内参物进样质量为m_s时测得的峰面积，f_s =>m_s />A_s是其校正因子。对于其他待测成分（以符号x表示），m_x是x成分的进样质量，A_x是x成分进样质量为m_x时测得的峰面积，f_x =>m_x />A_x是x成分的校正因子。x成分与s成分间的相对校正因子f_x/s的计算公式为f_x/s>=>f_x>/>f_s>=>m_x×A_s) />m_s×A_x)。

取步骤（3）制备得到的混合对照品溶液，进样10 μL进行高效液相色谱分析，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图（如图1所示），波长274 nm，峰1：没食子酸；峰2：羟基芍药苷；峰3：儿茶素；峰4：芍药内酯苷；峰5：芍药苷；峰6：没食子酸乙酯；峰7：没食子酰基芍药苷；峰8：五没食子酰葡萄糖；峰9：苯甲酸；峰10：苯甲酰芍药苷；峰11：丹皮酚。

色谱图积分得到芍药苷和其他各待测成分的峰面积，并以公式f_x/s>=>m_x×A_s)>m_s> A_x)分别计算各待测成分与芍药苷间的相对校正因子，没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚10种成分对于芍药苷的相对校正因子分别为0.0349、0.0615、0.149、1.08、0.0328、0.101、0.0417、0.190、0.607、0.0202。

（5）样品中多指标成分的测定

取步骤（2）的供试品溶液，进样10 μL注入高效液相色谱仪进行测定，得到白芍提取液的高效液相色谱图（如图2所示），波长274 nm，峰1：没食子酸；峰2：羟基芍药苷；峰3：儿茶素；峰4：芍药内酯苷；峰5：芍药苷；峰6：没食子酸乙酯；峰7：没食子酰基芍药苷；峰8：五没食子酰葡萄糖；峰9：苯甲酸；峰10：苯甲酰芍药苷；峰11：丹皮酚，色谱图积分得到芍药苷和其他各待测成分的峰面积。

供试品溶液中芍药苷的进样质量m_s’由芍药苷对照品以外标定量法测定得到，供试品溶液中其他待测成分的进样质量m_x’由公式m_x ’=>f_x/s>m_s’×(A_x ’/>A_s’)计算得到。此公式中的A_s’和A_x’是对供试品溶液分析测得的内参物和其他待测成分的峰面积，f_x/s是步骤（3）测得的各待测成分与芍药苷间的相对校正因子。由测定或计算得到的进样质量m_s’和m_x’，除以进样体积，计算得到样品中各待测成分的浓度，结果如下：没食子酸18.41>

（6）步骤（4）和步骤（5）所用的高效液相色谱参数如下：

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪；

色谱柱：Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 × 4.6 mm）；

流动相：质量分数0.01%磷酸水溶液-乙腈；

洗脱程序为线性梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0~20 min，8%；20~50 min，从8%线性增加到24%；50~60 min，50%；60~68 min，从50%线性增加到90%；

流速：1.0 mL/min；

柱温：27 ℃；

检测波长：羟基芍药苷，257 nm；没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚，274 nm。

（7）本发明方法的方法学考察结果如下：

（7.1）线性关系考察

取步骤（3）制备得到的混合对照品溶液。按步骤（6）中的色谱条件分别进样2、5、10、20、35、50 μL进行测定，记录相应的峰面积。以各成分浓度（μg/mL）乘以进样体积（μL）得到被测成分进样质量（ng）作为自变量X，以峰面积作为因变量Y，进行线性回归。11种成分的回归方程和线性范围如表1所示。结果表明，11个成分在考察的浓度范围内线性关系良好。

表1. 线性关系考察结果

（7.2）精密度、重复性、稳定性考察

取步骤（2）制备得到的同一份供试品溶液，按步骤（6）中的色谱条件重复进样6次，按步骤（5）测得11个成分浓度的RSD如表2所示。结果表明，精密度良好。

由于建立的分析方法没有供试品前处理和稀释过程，所以重复性试验考察方式为取步骤（1）得到的同一份白芍提取液，装到6个进样瓶中作为供试品溶液，按步骤（6）中的色谱条件分别进样分析，按步骤（5）测得11个成分浓度的RSD如表2所示。结果表明，重复性良好。

取步骤（2）制备得到的供试品溶液，在常温下放置0、1、2、4、8、12、24小时后按步骤（6）中的色谱条件进样，按步骤（5）测得11个成分浓度的RSD如表2所示。结果表明，11个成分在常温下24小时内稳定。

表2. 精密度、重复性、稳定性考察结果

（7.3）加样回收率考察

按步骤（1）和步骤（2）分别制备得到6份供试品溶液，按步骤（5）测定11种成分的浓度。分别取6 份供试品溶液各0.1 mL，精密加入步骤（3）制备得到的混合对照品溶液0.1 mL混匀，按步骤（5）测定11种成分浓度，并计算各成分的加样回收率。测定结果如表3所示，加样回收率在96%~107%范围内，表明该方法的准确度良好。

表3. 加样回收率（%）考察结果

（8）本发明方法与外标法测定结果比较

以外标法对步骤（5）中的同一份供试品溶液进行测定，得到各待测成分浓度如下：没食子酸19.18 μg/mL、羟基芍药苷62.44 μg/mL、儿茶素61.22 μg/mL、芍药内酯苷353.7 μg/mL、芍药苷5879 μg/mL、没食子酸乙酯63.09 μg/mL、没食子酰基芍药苷98.35 μg/mL、五没食子酰葡萄糖251.4 μg/mL、苯甲酸112.0 μg/mL、苯甲酰芍药苷268.8 μg/mL、丹皮酚18.42μg/mL。步骤（5）中本发明方法测定结果与外标法基本一致，相对偏差在-5.7%~+1.7%范围内，表明本发明方法能准确且低成本地测定11种指标成分的含量。

实施例2

一种白芍提取液中多指标成分含量的测定方法，该方法包括以下步骤：

（1）白芍提取液的制备

白芍药材（产地为浙江东阳）粉碎、过筛至20~80目，取5 g粉末，加入25 mL容量瓶，加体积分数为70%的乙醇水溶液25 mL超声提取（超声功率500W，40kHz）40 min，提取结束，溶液放冷至常温后，定容至刻度线，即得白芍提取液。

（2）供试品溶液的制备

直接将步骤（1）得到的白芍提取液作为供试品溶液，无前处理和稀释。

（3）对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品479.75 mg，加体积分数30%的甲醇水溶液溶解并定容至5 mL，制成对照品储备液。

然后精密吸取上述对照品储备液640 μL，加浓度为30%甲醇水溶液稀释定容至10mL，得到浓度为6141 μg/mL的芍药苷对照品溶液，于4℃保存，备用。

（4）样品中多指标成分的测定

取步骤（2）得到的供试品溶液和步骤（3）得到的芍药苷对照品溶液，分别进样10 μL进行高效液相色谱分析，得到白芍提取液的高效液相色谱图和芍药苷对照品溶液的高效液相色谱图，色谱图积分得到白芍提取液中各待测成分的峰面积及芍药苷对照品溶液中芍药苷的峰面积。

供试品溶液中芍药苷的进样质量m_s’由芍药苷对照品溶液以外标定量法测定得到，供试品溶液中其他待测成分的进样质量m_x’由公式m_x’ =>f_x/s×m_s ’×>A_x ’/>A_s’)计算得到。

没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚10种成分对于芍药苷的相对校正因子在本发明方法的开发过程中已测定，具体测定过程可参考实施例1的步骤（4），测定结果分别为0.0349、0.0615、0.149、1.08、0.0328、0.101、0.0417、0.190、0.607、0.0202，可直接使用。

由测定或计算得到的进样质量m_s’和m_x’，除以进样体积，计算得到样品中各待测成分的浓度，结果如下：没食子酸25.09>

（5）步骤（4）所用的高效液相色谱参数如下：

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪；

色谱柱：Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 × 4.6 mm）；

流动相：质量分数0.01%磷酸水溶液-乙腈；

洗脱程序为线性梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0~20 min，8%；20~50 min，从8%线性增加到24%；50~60 min，50%；60~68 min，从50%线性增加到90%；

流速：1.0 mL/min；

柱温：27 ℃；

检测波长：羟基芍药苷，257 nm；没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸乙酯、没食子酰基芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚，274 nm。

（6）本发明方法与外标法测定结果比较

以外标法对步骤（4）中的同一份供试品溶液进行测定，得到各待测成分浓度如下：没食子酸25.79 μg/mL、羟基芍药苷92.41 μg/mL、儿茶素607.1 μg/mL、芍药内酯苷7913 μg/mL、芍药苷6127 μg/mL、没食子酸乙酯0 μg/mL、没食子酰基芍药苷131.2 μg/mL、五没食子酰葡萄糖460.6 μg/mL、苯甲酸572.8 μg/mL、苯甲酰芍药苷368.7 μg/mL、丹皮酚17.64 μg/mL。步骤（4）中本发明方法测定结果与外标法基本一致，相对偏差在-3.9%~+4.0%范围内，表明本发明方法能准确且低成本地测定11种指标成分的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。