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法律状态
2020-02-18
授权
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2019-04-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C09B57/00 申请日:20181110
实质审查的生效
2019-03-19
公开
公开
技术领域
本发明涉及一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物及应用,特别涉及一类用于靶向细胞核的染料化合物,其属于精细化工领域。
背景技术
细胞核是真核细胞维持基因完整性和调节细胞功能的主要细胞器,内部含有大量的遗传物质,即DNA。每个真核细胞中大约含有两米长的DNA,这些DNA与蛋白质作用形成了高度结构化的染色质。DNA主要是以染色质或染色体的形态存在于细胞核中。细胞核对细胞功能的调节主要是通过对管控DNA的活动来实现的。因此研究细胞核中高度结构化的染色质或染色体对研究细胞核及控制细胞生命活动具有重要的意义。
在生物成像领域,遗传物质的可视化研究对于研究细胞活动具有重要的意义。Hoechst和DAPI是两种能够与DNA结合的染料,但是Hoechst和DAPI的激发光波长较短,在成像过程中细胞会受到光毒性的影响从而导致正常的生理过程紊乱或造成严重的细胞损伤,并且Hoechst和DAPI只能够单纯的靶向于细胞核却无法实现其他功能,如pH值测量等。为了不影响细胞的正常生理功能,合成一类具有较高的生物兼容性的功能性细胞核靶向染料具有重要的研究价值。
发明内容
为了寻找一类具有优异细胞核靶向性的荧光染料,实现细胞核的可视化和研究细胞核遗传物质的功能,本发明提供了一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物,该化合物是基于磺酸罗丹明和Hoechst两种可用于细胞显微成像的荧光染料合成的一类磺酰胺罗丹明化合物。与普通罗丹明一样,磺酸罗丹明不仅具有较高的荧光量子产率,还具有容易进行功能化修饰的特点。另外,磺酸罗丹明的激发波长较长,成像过程中对细胞损伤较小。以传统的细胞核染料Hoechst作为DNA的靶向基团,通过Click反应将Hoechst与不同的具有生物兼容性的磺酰胺罗丹明发色团连接得到了一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物。
本发明采用的技术方案是:一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物,该化合物具有如下结构通式:
通式中,
所述
R5与R6都采用与同侧N原子及苯环上碳原子构成的六元环状结构的结构如下:
一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物的制备方法,该化合物通过炔基磺酰胺罗丹明与叠氮基Hoechst或叠氮基磺酸胺罗丹明与炔基Hoechst通过Click反应得到,制备方法如下:
其中:R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8和Y的定义同权利要求1通式中的定义,
一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物的应用,该化合物能够与DNA特异性结合,靶向细胞核内的DNA;该化合物还能够靶向细胞核,从而监测活体细胞细胞核内遗传物质的活动。
本发明的有益效果是:通过带有炔基的磺酰胺罗丹明与带有叠氮基的Hoechst或带有叠氮基的磺酰胺罗丹明与带有炔基的Hoechst通过Click反应得到了不同连接方式和带有不同链长的一类具有细胞核靶向功能的DNA染料化合物。该化合物具有优异的细胞核靶向性,解决了传统的罗丹明荧光团不能定位到细胞核的问题,同时克服了Hoechst因激发光波长较短,在成像过程中造成细胞严重损伤的问题,为生物细胞细胞核成像提供了更多可选择的工具。
附图说明
图1是化合物HoeSR用ctDNA滴定的荧光光谱。内示小图a是590nm处荧光强度对ctDNA加入量的拟合图。
图2是化合物HoeSR-1用ctDNA滴定的荧光光谱。内示小图b是590nm处荧光强度对ctDNA加入量的拟合图。
图3是化合物HoeSR对HeLa和MCF-7细胞进行染色的共聚焦荧光成像图,图c是HeLa细胞染色效果图,左侧是荧光场图,右侧是荧光场与明场混合图;图d是MCF-7细胞染色效果图,左侧是荧光场图,右侧是荧光场与明场混合图。
图4是化合物HoeSR-1对MCF-7细胞染色的共聚焦荧光成像图,通道一是450-540nm荧光采集图,通道二是560-660nm荧光采集图,明场是细胞核成像明场图,叠加场是通道一、通道二和明场的叠加图。
具体实施方式
本发明用以下实施例加以说明但不局限于此,其中除非另有说明,所有的份数和百分数均以重量计。
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例:
实施例1
氩气保护下,将化合物A1(50mg,98.50umol)与化合物B1(55mg,118.21umol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(60mg,62.04umol,62.98%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:967.4164。
实施例2
合成方法参照实施例1,用化合物B2代替B1,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:963.3864。
实施例3
合成方法参照实施例1,用化合物B3代替B1,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1019.4374。
实施例4
氩气保护下,将化合物A1(50mg,98.50umol)与化合物B4(63.79mg,118.21umol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(70mg,66.84umol,67.85%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1047.4823。
实施例5
氩气保护下,将化合物A2(50mg,83.94umol)与化合物B4(54.36mg,100.72umol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(50mg,44.04umol,52.47%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1135.5323。
实施例6
合成方法参照实施例1,用化合物B5代替B1,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:991.4164。
实施例7
合成方法参照实施例1,用化合物B6代替B1,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1047.4864。
实施例8
合成方法参照实施例1,用化合物B7代替B1,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1114.5264。
实施例9
氩气保护下,将化合物A1(50mg,98.50umol)与化合物B8(68.89mg,118.21umol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(60mg,54.33umol,55.15%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1104.5356。
实施例10
合成方法参照实施例9,用化合物B9代替B8,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1038.4964。
实施例11
合成方法参照实施例9,用化合物B10代替B8,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1202.5664。
实施例12
合成方法参照实施例9,用化合物B11代替B8,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1178.5665。
实施例13
合成方法参照实施例9,用化合物B12代替B8,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1207.6031。
实施例14
氩气保护下,将化合物A1(50mg,98.50umol)与化合物B13(86.26mg,118.21umol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(85mg,68.68umol,69.73%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:618.8258。
实施例15
合成方法参照实施例14,用化合物B14代替B13,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1176.6180。
实施例16
合成方法参照实施例14,用化合物B15代替B13,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1124.5756。
实施例17
合成方法参照实施例14,用化合物B16代替B13,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1096.5478。
实施例18
合成方法参照实施例14,用化合物A2代替A1,化合物B16代替B13,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1121.5260。
实施例19
氩气保护下,将化合物A3(10mg,21.62μmol)与化合物B17(13.09mg,25.94μmol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(11mg,11.37μmol,52.61%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:967.4204。
实施例20
合成方法参照实施例19,用化合物B18代替B17,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1051.4575。
实施例21
合成方法参照实施例19,用化合物B19代替B17,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1077.5164。
实施例22
合成方法参照实施例19,用化合物B20代替B17,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:553.2718。
实施例23
合成方法参照实施例19,用化合物B21代替B17,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1071.4914。
实施例24
氩气保护下,将化合物A4(10mg,18.16μmol)与化合物B21(13.27mg,21.79μmol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(10mg,8.63μmol,47.49%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1159.5560。
实施例25
氩气保护下,将化合物A3(10mg,21.62μmol)与化合物B22(13.71mg,25.94μmol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(11mg,11.10μmol,51.33%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:991.4204。
实施例26
合成方法参照实施例25,用化合物B23代替B22,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1047.4912。
实施例27
合成方法参照实施例25,用化合物B24代替B22,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1200.6072。
实施例28
合成方法参照实施例25,用化合物B25代替B22,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1203.5654。
实施例29
合成方法参照实施例25,用化合物B26代替B22,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1176.6099。
实施例30
氩气保护下,将化合物A3(10mg,21.62μmol)与化合物B27(13.71mg,13.62μmol)加至反应瓶中,加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴N,N-二异丙基乙胺,室温下反应24h,减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离(馏出液CH2Cl2:MeOH=8:1),得到紫色固体(11mg,11.10μmol,51.33%)。产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1006.4425。
实施例31
合成方法参照实施例30,用化合物B28代替B27,产物结构通过HRMS鉴定,HRMS[M+H]+:1046.4738。
实施例32
将实施例1所对应的化合物HoeSR进行DNA滴定光谱实验。将化合物HoeSR配制为1μM的测试液,小牛胸腺DNA(ctDNA)使用Tris-HCl缓冲液溶解,通过测定溶液吸光度,并根据琅勃比尔定律以及ctDNA特定的摩尔消光系数6600L·mol-1·cm-1计算出小牛胸腺DNA缓冲液溶液的浓度为6.0×10-4M。
使用530nm激发光照射化合物HoeSR的1μM测试液,采集560-720nm波段的光谱。如图1所示,化合物HoeSR在590nm处的荧光强度均随着ctDNA加入量的增加而升高最终达到饱和,内示小图a为590nm处的荧光强度对ctDNA加入量的拟合图,通过滴定曲线,得到HoeSR和ctDNA的结合常数为4.2μM。
实施例33
将实施例19所对应的化合物HoeSR-1进行DNA滴定光谱实验。将HoeSR-1配制为1μM的测试液,小牛胸腺DNA(ctDNA)使用Tris-HCl缓冲液溶解,通过测定溶液吸光度,并根据琅勃比尔定律以及ctDNA特定的摩尔消光系数6600L·mol-1·cm-1计算出小牛胸腺DNA缓冲液溶液的浓度为6.0×10-4M。
使用530nm激发光照射化合物HoeSR-1的1μM测试液,采集560-720nm波段的光谱。如图2所示,化合物HoeSR-1在590nm处的荧光强度均随着ctDNA加入量的增加而升高最终达到饱和,内示小图b为590nm处的荧光强度对ctDNA加入量的拟合图。通过滴定曲线,得到HoeSR-1和ctDNA的结合常数为8.12μM。
实施例34
将实施例1所对应的化合物HoeSR进行细胞成像实验,将HeLa细胞和MCF-7细胞在37℃,5%的CO2细胞孵育箱中孵育24小时后,使用1μM的HoeSR染色孵育30分钟,进行共聚焦成像验证其细胞核定位性。如图3所示,图c是HeLa细胞染色效果图,左侧是荧光场图,右侧是荧光场与明场混合图;图d是MCF-7细胞染色效果图,左侧是荧光场图,右侧是荧光场与明场混合图。通过共聚焦成像图片可以清楚观察到化合物HoeSR定位到HeLa细胞和MCF-7的细胞核中。
实施例35
将实施例19所对应化合物HoeSR-1进行细胞成像实验,将MCF-7细胞在37℃,5%的CO2细胞孵育箱中孵育24小时后,使用1μM的HoeSR-1溶液染色孵育30分钟,405nm光激发双通道采集进行共聚焦成像。如图4所示,通道一是450-540nm荧光采集图,通道二是560-660nm荧光采集图,明场是细胞核成像明场图,叠加场是通道一、通道二和明场的叠加图,通过共聚焦成像图片可以清楚观察到化合物HoeSR-1定位到MCF-7的细胞核中。
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