一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法

摘要

本发明涉及一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法，首先在原位污染土壤中种植植物，并在植物根际接种植物促生细菌，通过常规培养，浇水、保湿，利用促生菌的促生特性促进植物生长以及产有机酸特性活化污染土壤中重金属从而强化植物高效积累污染土壤重金属，同时充分发挥植物‑微生物‑土壤三者相辅相成的互作关系，充分发挥植物和微生物修复技术的优势，改善单一植物修复中修复效率较低、植株生物量小、修复周期较长等缺点，达到彻底修复土壤重金属污染的目的。

说明书

技术领域

本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种促进超积累植物生长发育及强化积累土壤重金属的生物修复试剂及促进超积累植物生长及其积累复合污染土壤重金属的微生物辅助植物的修复方法。

背景技术

随着工农业生产的快速发展，生产力水平快速提高，产生了大量有毒有害的化学物质，导致环境污染日趋加重。重金属土壤污染问题尤为凸显。重金属污染具有隐蔽性、普遍性和不可降解等特点，目前重金属污染被认为是我国土壤质量下降的主要因素，重金属污染土壤的环境污染问题已迫在眉睫。重金属污染对农作物的生产、产量和品质都会产生严重毒害，农作物受到重金属危害后，植株矮小生长发育缓慢，作物生产力下降。水稻受害后叶鞘和叶片黄化，并在籽粒中大量积累重金属。沿着食物链逐级富集，危及人体健康。在我国有65％的人口主食以稻米为主，因此修复重金属污染土壤己经成为当前环境最严峻的问题。

植物修复技术在生物修复技术中作为一种修复有毒重金属污染的绿色环保技术，应用最为广泛。但当植物中积累的重金属浓度过高会使植物组织产生不可逆转的伤害，导致植物生长能力下降，甚至会导致死亡。因此若想提高植物修复能力，当务之急为提高植物的生长能力和对重金属的积累能力。通过不断地研究实践，发现以植物修复为主微生物修复为辅，将两种方式结合能够改善自身方法的不足之处，发挥自身优势提高植物对重金属的转移和吸收能力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种促进超积累植物生长发育及强化超积累植物积累土壤重金属的细菌菌株。

本发明的另一目的是提供一种促进植物生长及强化积累土壤重金属的生物修复试剂。

本发明的又一目的是提供利用该生物修复试剂的促进植物生长发育及其积累复合污染土壤重金属的植物-微生物联合修复方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种促进植物生长及强化超积累植物积累土壤重金属的细菌菌株，分类命名为Bacillus aryabhattai PGP5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018 年10月19日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018695。

该植物根际细菌是从中国湖北房县铅锌污染矿区植物根际土壤中分离得到，经鉴定为芽孢杆菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，干燥，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，有芽孢，无鞭毛。生物学实验中甲基红反应，淀粉水解，明胶水解，脲酶活性，H₂S产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，且能够利用柠檬酸盐，但VP实验为阴性，综合鉴定菌株为芽孢杆菌属。

一种促进植物生长发育及强化积累土壤重金属的生物修复试剂，所述的生物修复试剂含有芽孢杆菌属菌株，所述的芽孢杆菌属菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月19日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018695。

该生物修复制剂为液体制剂，其中液体制剂中芽孢杆菌属菌株有效活菌数为 2亿个/mL以上，优选为8.58亿个/毫升以上。所述的液体制剂通过常规的液体发酵方法发酵所述的芽孢杆菌属菌株制备得到。

或者，该生物修复制剂为固体制剂，其中保藏号为CCTCC NO：M2018695 的芽孢杆菌属菌株的有效活菌数为2亿个/g以上，优选为8.58亿个/g以上。通过冷冻干燥的方法，将所述的芽孢杆菌属菌株发酵液配制成粉剂，即得到固体制剂。

一种促进植物生长发育及强化积累土壤重金属的生物修复方法，具体步骤为：在原位污染土壤中种植植物，并在植物根际接种所述的促进植物生长及强化积累土壤重金属的生物修复试剂，利用生物修复试剂促进植物生长发育并产生有机酸，提高植物积累污染土壤重金属的能力，大d大提升植物对重金属的转移和吸收。

植物为龙葵和/或土荆芥。

龙葵和/或土荆芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后浇Hoagland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中。

重金属原位污染农田土壤从南京栖霞山铅锌矿区采集获得，其土壤为铅、锌、镉复合污染土壤，其中土壤中重金属含量分别为Pb：919.46mg/Kg、Zn：2087.62 mg/Kg、Cd:10.23mg/Kg。

所述的生物修复试剂配制过程如下：将芽孢杆菌PGP5菌株接入LB培养基活化18-20h，得到的菌液为菌株种子液，然后按接种量5-10％v/v接入含LB培养基的发酵罐液体培养24-36h，28-35℃，200-300rmp/min发酵培养后下罐，所得的发酵液为含芽孢杆菌PGP5的生物修复制剂；将发酵液接种于植物根际，每千克土壤接种10⁸个细菌/mL的发酵液30-50mL，分1-2次接种。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：通过本发明的生物修复试剂及方法进行修复处理后，地上部的株高与地下部的根长均呈明显的增加，且地上部与地下部的生物量均有明显的提高，表明PGP5能够促进超积累植物龙葵的生长；土荆芥接菌以后也呈现了相同的趋势，因此，菌株PGP5对龙葵和土荆芥有明显的促生作用。两种植物在接菌后发现与对照相比对重金属铅、锌、镉的提取效果和单位提取量明显增强，但是单位质量的铅和锌的提取效果不显著，表明接入菌株 PGP5后提取铅和锌重金属效果增加，且对两种超积累植物的促生作用强烈，所以会导致单位提取重金属效果不显著，但总提取量增加，表明菌株PGP5能够促进超积累植物龙葵和土荆芥积累复合污染土壤中的重金属，对重金属污染的修复有重大意义。同时土壤有效态的结果表明，接菌PGP5后龙葵根际土壤Zn、Pb、和Cd的有效态都有明显的提高，土荆芥在接菌后土壤的Zn、Pb、和Cd有效态都也有所增加，这是因为土荆芥根际提取了更多的重金属，这些都表明菌株PGP5 对超积累植物龙葵和土荆芥有很强的促生作用，同时能强化超积累植物龙葵、土荆芥积累污染土壤重金属。

总之，本发明使得植物与微生物共同作用，利用土壤一微生物植物的共存关系，充分发挥植物和微生物修复各自的优势，取长补短，可以起到克服植物修复周期长的缺点，从而提高植物修复效率，达到彻底修复土壤重金属污染的目的。此技术安全、绿色、廉价、环保。因此，选用植物-微生物联合应用于复合污染土壤治理领域，使这两种修复技术能够最大程度展现联合优势，在土壤重金属修复领域具有更大的修复潜力。

附图说明

图1为芽孢杆菌PGP5在低氮固体培养基上生长情况示意图；

本图为测定芽孢杆菌PGP5是否具有固氮特性，如具有，则可以在低氮固体培养基上生长良好；

芽孢杆菌属菌株PGP5，分类命名为Bacillus aryabhattai PGP5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月19日，菌种保藏号为CCTCC NO： M2018695，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

以下实施例所用的微生物细菌为芽孢杆菌属。

实施例1芽孢杆菌PGP5的筛选、鉴定及生物学特征(结果详见表1、表2、表3、图1)

1)土壤样品来源湖北房县铅锌矿植物根际土壤(海拔：1117米，经度：107° 33′56″W，纬度：33°34′7″N)。采集人：张周，联系电话：025-84396391，采集单位：南京农业大学。采集时间：2016年7月16日。

2)菌株筛选：取采集的植物根系土壤样品10g，放入含90mL无菌水的锥形瓶内，摇床中振荡20min，静置20-30s，制成菌悬液。无菌条件下取1mL菌悬液放入盛 9mL无菌水试管中，混合匀均，依次用无菌水稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、>-6各种浓度稀释液。

取0.1mL上述浓度的稀释液分别涂布于富集培养基上，每个浓度分别设置三个重复。30℃倒置培养24h-36h，挑取不同形态的单菌落，经多次划线进行纯化。

3)耐镉性筛选：将经过多次划线分离纯化完全的菌株接种于耐镉培养基平板上，其中镉的浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1 (单位为mM)。对菌株进行耐镉性的筛选。

菌株单菌落接入新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化16h，6000rpm离心6min，弃上清，收集菌体沉淀，加入无菌水振荡摇匀。调节菌悬液OD＝1.0，按5％的接菌量将菌液接入实验体系。实验体系为含20mL牛肉膏蛋白胨的50 mL三角瓶，依次加入不同浓度的Cd溶液，每个浓度设置三个重复。Cd的浓度梯度为(mM)0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55， 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.2，1.5，不接菌的培养基为空白，以未加入Cd培养液为对照。30℃，150rpm培养24h后测定波长600处的吸光值(表1)。

4)IAA产生实验：将色氨酸配成2.5mg·mL^–1的溶液，避光过滤除菌。将有氮液体培养基分装与于15cm×15mm的玻璃试管中，每管4mL，121℃高压蒸汽灭菌，冷却后，加入过滤除菌的色氨酸溶液1mL，使色氨酸的浓度为0.5mg·mL^–1。挑取纯化后的菌株接种于上述培养液中，摇床培养3d，用无菌枪头取出置于灭菌的10mL离心管中，6000r/min离心10min，用无菌枪头取出1ml上清液加50μL>–1的FeCl₃·6H₂O)充分混合，室温黑暗处显色30min，出现粉红色为阳性，说明有IAA产生。采用Salkowski′s比色法测可定性测定菌株利用色氨酸产IAA的能力。暗处反应后取出立即用分光光度计测定530nm波长处的吸光值。以不接菌的培养基做对照调零。结果表明PGP5菌株产IAA量高达52.92>

5)固氮能力检测：用灭菌的牙签将分离得到的细菌接种于低氮培养基中，28℃培养7d，转接三次观察是否生长，结果表明PGP5在缺氮培养基上生长良好(详见图1)。

6)有机酸种类及含量测定

初筛：将具有镉耐性的菌株点接于含碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基。30℃恒温倒置培养36h观察各菌株周围是否出现透明圈，对产透明圈菌株进行复筛。

复筛：将初筛菌株按1％接种量接入含YN液体培养基的锥形瓶中，并设置三个重复。将三角瓶置于30℃摇床上，在150r·min-1转速下，培养56h-72h。 8000rpm离心10min，用pH值测定仪测定这些菌株悬浮液的pH值。

选取可以产酸的菌株进一步培养，菌株在含不同Cd浓度的YN液体培养基中培养48h后4℃，6000rpm离心10min，上清液过阳离子树脂(Amberli te IR-120) 去除重金属离子，过0.22μm的无菌水系滤膜，滤液于4℃保存，待测。同时收集离心菌体沉淀，烘干称重备用。

有机酸标曲的制备：准确称取草酸100mg、酒石酸100mg、苹果酸100mg、柠檬酸100mg、琥珀酸100mg、乳酸100mg、甲酸500mg、乙酸500mg，加超纯水定容至100mL得有机酸混合母液。取0、5、10、15、20和25mL母液，加水定容至50mL为梯度标准液，4度保存备用。有机酸的浓度用高效液相色谱仪测定，波长214mm，分离柱型号为C18 Agilent Zorbax SB-AQ(4.6x250mm) 5μm column，流动相为含甲醇的20mM KH₂PO₄(pH>2PO₄:甲醇＝99:1)，流速为0.8mL/min，进样量20μL。

PGP5在不同镉浓度处理下，草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸的浓度随着镉浓度的增大均呈现了先增高又降低的趋势，且这六种有机酸的浓度7 在LD50的镉浓度下达到了最大值。甲酸变化最大，在LD50的镉浓度下甲酸浓度高达20054.40mg/g，而对照情况下甲酸浓度仅为11.84mg/g。在镉处理后，柠檬酸含量有明显降低趋势(详见表3)。

6)菌株解P能力的测定

无菌条件下用接种环将上述菌株分别点接于PKO培养基上，28℃倒置培养 5d，观察菌株的生长情况，选择菌落周围透明圈直径较大的菌株，接种到NBRIP 液体培养基中，30℃往复摇床170r·min-1培养7d，将培养液以3000r·min^-1离心，将样品(离心后去除菌体的NBRIP培养液)1mL转移至25mL容量瓶中，用水稀释至约15mL，加入二硝基酚指示剂2-3滴，并用4N的氢氧化钠溶液调解至溶液呈微黄色，准确加入2.5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，室温15℃以上，放置30min，用722型分光光度计测定700nm处溶液吸光值。

7)ACC脱氨酶活性测定

将菌株接入新鲜的YN培养基中进行活化，过夜培养约16h后，按5％接种量接种至50ml锥形瓶中，比例为DF:YN＝20:1，摇床培养24h后将DF培养液中的菌株接种到ADF固体培养基上，28℃培养箱培养7天观察菌落生长情况。

8)菌株鉴定：

通过16S rDNA序列分析法鉴定菌种，PCR扩增采用16S rDNA通用引物：

PCR扩增采用16S rDNA通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID No.1)

1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID No.2)

PCR反应体系(25μL)：Mix12.5μL、引物F 1μL、引物R 1μL、基因组DNA 2μL、无菌水8.5μL。反应条件94℃预变性5min，94℃变形15s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃充分延伸10min。扩增产物送南京金唯智生物技术有限公司测序。测序结果经NCBI网站上BLAST进行碱基序列比对，比对结果与芽孢杆菌亲缘关系最近。通过一系列生理生化反应，观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，干燥，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，

有芽孢，无鞭毛。生物学实验中甲基红反应，淀粉水解，明胶水解，脲酶活性，H₂S产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，且能够利用柠檬酸盐，但VP实验为阴性，综合鉴定菌株为芽孢杆菌属。

表1芽孢杆菌PGP5对镉的耐受浓度研究

注：LD₂₅为抑制率达到25％的Cd浓度，LD₅₀为抑制率达到50％的Cd浓度，>

表2芽孢杆菌PGP5的植物促生特性研究

表3菌株PGP5产小分子有机酸定量测定

实施例2液体制剂

将芽孢杆菌PGP5接入LB培养基活化18-20h，按接种量5-10％(v/v)接入LB培养基30℃，150-200rpm/min摇床培养20h-24h为发酵种子液，液体种子LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0。

发酵罐发酵：

发酵罐培养基配方：胰蛋白胨5-10％，酵母提取物5-10％，氯化钠5-10％，其余为水，pH值消毒前7.0-7.8，消毒后pH 6.8-7.5所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；将上一步得到的种子液以待接种培养基体积百分比 5％-10％的接种量接种到发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28-35℃条件下培养 24-36h，通气量1-2Vol/vol·min，搅拌转速200-300rpm，发酵完成后的发酵液即为微生物液体菌液制剂。

本实施例只是一种建议的生物修复制剂制备方法，实际上本发明生物修复制剂可通过常规的微生物发酵培养方法制备得到，只要培养液中菌体数量达到2 亿/mL以上即可，经测定发酵液中菌体数量为8.58亿/ml。

实施例3固体制剂

将实施例所得的培养液采用离心机，8000rpm离心15-20min，获得PGP5纯菌体，其中加入保护剂(蔗糖4.51mg/g、海藻糖0.9mg/g、葡萄糖9.6mg/g的方式比例)，采用冷冻干燥的方法即可制成固体菌剂原粉。每升发酵液可制备 PGP5菌体固体菌粉2.3909g。经检测，该固体生物修复制剂中测定有效活菌数为3.588×10¹¹个/g。

实施例4接种芽孢杆菌PGP5后植物龙葵、土荆芥生长及积累土壤中的重金属情况

通过在南京栖霞山铅锌矿采集重金属复合污染农田土壤，风干磨碎过筛后，装入塑料盆钵，每盆0.6Kg，加水使其含水量为田间持水量的60％，保持2天，龙葵种子和/或土荆芥用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min后，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后可浇Hoagland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中，每盆播入2株苗。接种含芽孢杆菌PGP5的液体生物制剂30-50mL/Kg 土壤，分1-2次接种，对照接等量无菌水。植株生长期间每天以称重法加入去离子水，保持土壤湿度为田间持水量的60％，种植20天收苗。将盆钵内植株小心取出，并收集根际土壤，将植株用清水冲洗三遍，用去离子水冲洗三遍已去除植物表明残留的土壤杂质，小心擦干植株表面水分，用剪刀将其地上部地下部相连部位剪断，用带刻度直尺测量其长度并称重，记录数值。植株在105℃下杀青30 min，80℃烘干至恒重后称其地上部及根系干重。同时收集植物表面根际土壤， 35℃烘干至恒重。

植物重金属含量测定：烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎混匀，称取植物干样0.2000g置于消煮管中，用HNO₃–HClO₄(V：V＝87：13)混合液消煮，ICP>

土壤有效态的测定：用pH为4.8的1mol/L的乙酸铵溶液提取有效态重金属。具体为取4g过20目筛的风干土样于100mL锥形瓶中，加入20mL的乙酸铵溶液，在水平摇床上以150rpm/min的速度震荡15min，然后静置10min，用双层定量滤纸过滤，取5ml滤液加入5ml5％的硝酸，混匀。用ICP-OES来测定提取液中重金属Zn、Pb、和Cd的含量。

实验结果表明，龙葵接菌PGP5(+PGP5)后与对照(CK)相比，地上部的株高与地下部的根长均呈明显的增加，且地上部与地下部的生物量均有明显的提高，表明PGP5能够促进超积累植物龙葵的生长，土荆芥的地上部与地下部生物量也明显增加，表明菌株PGP5对龙葵和土荆芥有明显的促生作用。两种植物在接菌后发现与对照相比对重金属铅、锌、镉的提取效果明显增强。但是土荆芥单位质量的镉、铅和锌的提取效果不显著，表明接入菌株PGP5后提取铅和锌重金属效果增加，而对两种超积累植物的促生作用强烈，所以会导致单位提取重金属效果增加不显著，但总提取量增加，表明菌株PGP5能够促进超积累植物龙葵和土荆芥积累复合污染土壤中的重金属，对重金属污染的修复有重大意义(详见表 4、5、6)。同时土壤有效态的结果表明(表7)，接菌PGP5后龙葵根际土壤 Zn、Pb、和Cd的有效态都有明显的提高。

表4龙葵、土荆芥接菌PGP5后生物量的变化

其中“CK”表示未接菌，“PGP5”表示接菌PGP5，下同。R表示Root，S表示Shoot

表5龙葵、土荆芥接菌PGP5后提取重金属的情况

表6龙葵、土荆芥接菌PGP5后单位重金属提取量

表7龙葵、土荆芥接菌PGP5后根际土壤有效态

附件1芽孢杆菌PGP5的测序结果

CCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGT GACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGA TCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAAT CCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGC CCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTT AGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGC GGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA CCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGA GGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGC GACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGG GCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACA GACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTT CACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGT TTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGA AACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCT ACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGT ACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAG AGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGA CTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGG GCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCA TCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGC CCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAG AAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACA GGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGC AAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGAC(SEQID No.3)

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法

<130> xhx2018112802

<141> 2018-12-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1405

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 3

ccttacggtt actccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt 60

gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca 120

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