一种硅质体纳米粒子药物载体及其诊断治疗制剂和制备方法

摘要

本发明公开了一种硅质体纳米粒子药物载体及其诊断治疗制剂和制备方法。该载体是由荧光两亲性分子和含硅复合脂质体掺杂水化自组装形成的、具有脂质双分子层结构的囊泡；所述荧光两亲性分子是以丙三醇骨架结构为核心、键连疏水长链和荧光基团形成的化合物；所述含硅复合脂质体由含硅的无机前体、疏水脂质链以及将二者偶联的连接基团组成；含硅复合脂质体的含硅的无机前体水解缩合形成无机硅酸盐网状结构分布于囊泡的表面。以该载体包载药物制备的诊断治疗制剂具有高稳定性并结合了pH值、光热响应两种药物控释机制，并增强了荧光基团的稳定性；将化疗和光热治疗相结合，有效降低了肿瘤的复发率。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种硅质体纳米粒子药物载体、及 具有高稳定性和药物控释功能的硅质体纳米靶向诊断治疗制剂及其制备方法。

背景技术

利用纳米粒子平台进行诊断治疗是癌症治疗的重要手段之一。其中，对于脂 质体的应用较为广泛。脂质体，是指磷脂分散在水中时，电镜观察可形成多层囊 泡，且每一层均为脂质双分子层，囊泡中央和各层之间被水相隔开形成的闭合囊 泡。可由天然或人工合成脂质组成，该类分子都由亲水的头部和亲脂的尾部两部 分构成，膜壁厚度一般为5～7nm。由于细胞膜的化学成分主要是类脂和蛋白质， 因此脂质体在很长一段时间内被作为生物膜的模型来研究细胞膜的性质。然而， 作为纳米药物载体，脂质体仍旧存在一定的问题，制备技术和工业化生产仍旧存 在很大难度，且对于水溶性药物包封率较差，药物极易从脂质体中渗漏，因此难 以商品化，而所需的原料如卵磷脂胆固醇等在国内的合成和提纯目前仍在探索阶 段，缺少成熟的制备工艺。硅质体由于其表面硅酸盐层(硅氧烷网络)的作用， 这种无机框架使得硅质体在形态上比传统的脂质体更加稳定。硅氧烷的网络结构 则可以通过傅里叶变换红外光谱来测定，伸缩振动在1100和950cm^-1的吸收峰>

传统的化疗、放疗等治疗方法存在选择性差、毒副作用大等问题。光热治疗 是一种具有应用前景的非侵害性的癌症疗法。由于近红外激光辅助光热疗法优异 的渗透性和定点杀伤性，大量的研究都着眼于开发尺寸合适的近红外光热治疗剂。 同时，绝大多数近红外光热治疗剂在受到近红外波段光激发可产生近红外荧光， 因此近红外光热治疗的同时也可以通过近红外荧光分子的成像功能同步进行诊 疗一体化。目前，临床上针对肿瘤的传统治疗方法主要有手术切除，放射疗法和 化学疗法，但均存在一定局限性，如手术风险较高，放化疗的不良反应较大，缺 乏特异性，或容易出现耐药性，传统的治疗方法对于转移后的肿瘤作用有限，因 此恶性肿瘤致死率难以得到有效控制。基于纳米材料的光热疗法，因其肿瘤特异 性高、创伤小以及并发症少等优势，逐渐引起学术界的广泛关注。而光热治疗还 可以与化疗，免疫疗法等协同治疗，成为有效对抗肿瘤的多功能诊疗剂。纳米光 热材料发展至今，有机染料以其极低的生物毒性和较好的光热转化效率博得广泛 关注，目前较多的研究热点也在于有机染料物质之上，然而有机染料类物质在近 红外光照射多次后容易出现光漂白的情况，染料的光转换效率明显降低，不利于 重复利用，且单独的有机染料物质进入体内难以稳定的到达需要治疗的部位，因 此，通过组装成纳米粒子构建纳米平台体系进行光热治疗和诊疗一体化，这些光 热纳米诊疗剂有着良好的光热转化效率，而且能通过表面改性或键连其他材料等 方式实现多功能应用，已在动物实验中表现出极佳的疗效，值得人们继续探索， 具有远大的前景。

对于肿瘤的治疗，单纯的光热治疗容易导致复发，并且难以抑制肿瘤的转移， 而单纯的化疗则无法实现控释效果，对于非肿瘤的组织和器官毒性较高。因此， 将光热疗法和化疗相结合的“联合治疗”是一种更有效的策略。载有化疗药物和 光热转化药物的纳米颗粒系统可以靶向肿瘤区域，且协同抑制肿瘤的效率比单一 治疗效率更高。传统的联合治疗首选光热剂即为甲川菁类染料，而纳米载体往往 使用的是热敏脂质体，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，它有效的利用了脂质体 和热疗的双重优势来提高治疗效果，降低毒副作用，主要借助于不同温度时脂质 体膜结构的变化来调节药物的释放。

重大疾病，尤其是肿瘤的早期与精准诊断是提高其治愈率，并且改善患者生 存质量的关键所在。随着分子影像技术的发展，纳米分子探针在疾病的早期诊断， 活性药物筛选，以及实时评价治疗效果等多个方面都发挥着越来越重要的作用。 而在疾病的治疗方面，应用纳米技术作为抗肿瘤药物的载药系统的研究也已经取 得重大进展。纳米药物的靶向性、缓释性与控释性、以及可能的血脑屏障穿透性 等特性，使其与传统化疗药物相比具有显著的优势。

因此，应用纳米粒子构建“诊疗一体化”平台，进一步优化治疗的有效性和 安全性，在现有存在的纳米粒子的潜在毒性问题进行改善，降低载带化疗药物提 前释放造成的副作用，探索构建新型抗肿瘤纳米载体体系，并在此基础上进行诊 断和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明将荧光染料的光热效应与化疗药物光热控释结合，在提高药物靶向性 的同时，实现了光热治疗和化疗联合治疗的目的，融合两者优势，减少肿瘤复发。 同时，利用了硅质体的高稳定性，降低了药物的非预期释放。

本发明的目的之一是提供一种以致密硅酸盐网络结构作为外壳层的硅质体 纳米粒子，以提高纳米粒子的稳定性和生物安全性，同时赋予所包含的染料更强 的抗光漂白能力。

本发明的目的之二是提供一种同时具有多重刺激响应型药物控释功能和光 热-化疗联合治疗效果的诊断治疗一体化的纳米药物制剂，为解决化疗药物半衰 期短、药物靶向性和副作用差、单一治疗方式肿瘤的复发率高、诊断试剂和治疗 试剂需要分开给药、现有智能药物递送系统稳定性差等问题。(1)增加肿瘤化疗 药物在肿瘤部位的富集，减少药物副作用，增强生物安全性；(2)联合治疗策略 可提高疗效，减少肿瘤复发；(3)实现诊疗一体化，减少药物使用带来的不便。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种硅质体纳米粒子药物载体，所述载体是由荧光两亲性分子和含硅复合脂 质体掺杂、水化(水解缩合)、自组装形成的、具有脂质双分子层结构的囊泡； 所述荧光两亲性分子是以丙三醇骨架结构为核心、键连疏水长链和荧光基团形成 的化合物；所述含硅复合脂质体由含硅的无机前体、疏水脂质链以及将二者偶联 的连接基团组成；含硅复合脂质体的含硅的无机前体水解缩合形成无机硅酸盐网 状结构分布于囊泡的表面。荧光两亲性分子的亲水基团掺杂在含硅复合脂质体的 亲水基团之间，构成了脂质双分子层的外层和内层；含硅复合脂质体的疏水脂质 链和荧光两亲分子的疏水长链掺杂排列共同构成了脂质双分子层的内层和外侧 之间的中间层；中间层为包载疏水药物的空间，内层内侧的空腔为包载亲水药物 的空间。

进一步的优化方案为：含硅复合脂质体的无机前体含有(EtO)₃Si结构，(EtO)>3Si结构个数为1～3个；含硅复合脂质体包含的疏水脂质链个数为1～3个，所述>

进一步的优化方案为：荧光两亲性分子中的丙三醇骨架结构选用单硬脂酸甘 油酯，属于多元醇型非离子型表面活性剂，制备过程为天然油脂的甘油解反应， 产物常用于发泡剂，乳化剂，无明显毒性，分子量为358.56

进一步的，所述载体的囊泡实体直径为50～150nm。

进一步的，所述荧光基团为甲川菁类荧光染料。

一种具有药物控释功能的硅质体纳米靶向诊断治疗制剂，由权利要求1所述 的硅质体纳米粒子药物载体装载药物组成。

进一步的，装载的药物包括但不限于阿霉素、丝裂霉素、紫杉醇、喜树碱、 氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、奥沙利铂、虫草素、伊立替康、索拉非尼、 吉非替尼、莫达非尼、多西他赛、姜黄素、蓝萼甲素、鬼臼毒素。

一种具有药物控释功能的硅质体纳米靶向诊断治疗制剂的制备方法，包括以 下步骤：

1)荧光染料的制备；

2)荧光染料与丙三醇骨架结构的供价偶联获得荧光两亲性分子；

3)荧光两亲性分子与含硅复合脂质掺杂水化形成硅质体纳米粒子药物载体；

4)将抗癌药物包载到硅质体纳米粒子药物载体中。

进一步的，所述荧光染料为甲川菁类荧光染料，具体步骤为：

1)通过Fischer加成，取代反应制备甲川菁类荧光染料：将结构1与酮类通 过Fischer加成制备获得的吲哚啉结构2，通过取代反应获得结构3和结 构4，结构3和含有共振结构的次甲基共轭链类小分子结构5在氮气保 护下分散于乙酸酐中120℃搅拌反应得结构6，结构6与另一端的吲哚啉 结构单体分散于三乙胺中发生取代反应生成结构7，即得甲川菁类荧光 染料7；

2)甲川菁类染料和丙三醇骨架结构的共价偶联：通过化学偶联反应将步骤 1)制备的结构7偶联至丙三醇骨架结构的仲碳，从而将甲川菁类染料修 饰到丙三醇类骨架结构上；进行该步骤过程中需要用高位阻结构化合物 保护结构8的伯碳得到结构9，再在4-二甲氨基吡啶和1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐催化下通过取代反应连接到仲碳上的羟基上 得到结构10；而后使用三氟乙酸脱保护高位阻结构化合物得到结构11， 再使用酸酐类结构取代剩余的伯碳得到结构12。即得到荧光两亲性分子；

3)与含硅的复合脂质掺杂水化：将步骤2)制备的荧光两亲性分子与含硅 复合脂质体分散于有机溶剂中，旋蒸成膜后，用去离子水在50～60℃下 进行水化并在水相中涡旋并超声破碎，过夜放置，通过水解、缩合、自 组装步骤形成所述硅质体纳米粒子药物载体；

4)将抗癌药物包载到硅质体纳米粒子药物载体中：步骤3)制备的硅质体纳 米粒子药物载体除去外水相的硫酸铵，再与药物孵育，完成主动载药过 程，以磷酸盐缓冲液为洗脱剂,通过葡聚糖凝胶G-50柱法除去未包载的 药物；

其中结构1～结构12的结构如说明书附图8和9所示。

步骤1)中所使用的酮类包括但不限于甲基异丙基酮，丁酮，乙基异丙基酮； 所使用的吲哚啉结构包括但不限于吲哚、苯并吲哚、噻唑、苯并噻唑、萘噻唑、 咪唑、喹啉；所使用的次甲基共轭链包括但不限于戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐、丙 二醛双苯亚胺单盐酸盐。

步骤2)中所使用的高位阻结构化合物包括但不限4,4'-二甲氧基三苯基氯甲 烷，三苯基氯甲烷，所使用的酸酐类结构包括但不限于丁二酸酐，丙二酸酐，戊 二酸酐。

步骤3)中所使用的有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇、 三氯甲烷、二氯甲烷。

本发明中所述的制剂具有pH值响应性、光热响应性的多重刺激响应的药物 控释功能。

本发明中所述的制剂具有化疗和光热联合治疗的作用。

本发明中所述的制剂具有对于荧光基团具有结构保护和光照保护的作用。对 于包载的药物有防止提前释放的作用。

本发明的有益效果：

本发明的优点之一是使用了丙三醇骨架结构和硅质体壳层结构作为纳米靶向 诊断治疗平台，提高了纳米粒子的生物安全性，稳定性。同时提高了抗癌药物的 包封率和载药量，并且通过键连的方式提高了荧光染料的稳定性和包封率，保 证了其光热转化效率，大幅度提高甲川菁类染料在实际应用中的光热转化效率 和光热治疗以及成像效果。

本发明的优点之二是所述制剂将近红外荧光成像和光热-化疗联合治疗结合 在一起，实现诊疗一体化，实现影像引导下的治疗和监测药物的分布，并便于评 价治疗效果。

本发明的优点之三是所述制剂同时具有较好的稳定性以及对于pH和温度敏 感的药物控释，可以减少药物提前泄漏，提高药物在肿瘤组织的富集，减少药物 的毒副作用。

本发明的优点之四是所述制剂将光热治疗和化疗通过控制释放有机结合，提 高了治疗效果，减少了肿瘤复发，同时对于正常机体组织起到一定的保护作用。

附图说明

图1为硅质体纳米粒子药物载体剖面结构示意图；

图2为实施例1所述制剂的制备流程示意图。

图3为实施例1所得到的制剂的透射电镜图。该制剂为球形纳米粒子，实体直径 约100纳米，粒径均匀，可见明显的核壳样结构和外层致密结构。

图4为尾静脉注射实施例1制备的该制剂后，荷瘤鼠肿瘤部位的近红外荧光成像图。具体实验流程如实施例2所述。注射该制剂后的8小时后，肿瘤部位的近红 外荧光信号达到最强。

图5为实施例1制备的该制剂的光热升温和结构稳定性的体外效果评价。具体实验流程如实施例3所述，左图(A)表明在多次照射后，硅质体组较之于未掺杂 复合脂质体组以及单纯荧光染料组升温幅度更大，稳定性也更高。右图(B)表 明用表面活性剂处理后，硅质体组的粒径较之于传统脂质体组保持的更好。

图6为实施例1制备的制剂的多重刺激响应型药物控释的体外效果评价。具体实验流程如实施例4所述。左图(A)反映了该制剂优良的pH值响应性和温度响 应性的药物控释效果，右图(B)反映了该制剂优良的光热响应性药物控释效果。

图7为实施例1制备的制剂对荷瘤鼠的皮下种植瘤的治疗效果评价，纵坐标为测量当日肿瘤体积与第0天肿瘤大小的比值。具体实验流程如实施例5所述。该制 剂的光热和化疗联合治疗使肿瘤完全消融，且没有发现肿瘤的复发；

图8为实施例1步骤1)的各个化合物结构式；

标号1～7分别代表结构1～7；

图9为实施例1步骤2)的各个化合物结构式；

标号8～12分别代表结构8～12；

图10为所述含硅复合脂质结构示意图。

具体实施方式

如图1、2所示，一种硅质体纳米粒子药物载体，所述载体是由荧光两亲性 分子和含硅复合脂质体掺杂水化自组装形成的、具有脂质双分子层结构的囊泡； 所述荧光两亲性分子是以丙三醇骨架结构为核心、键连疏水长链和荧光基团形成 的化合物；所述含硅复合脂质体由含硅的无机前体、疏水脂质链以及将二者偶联 的连接基团组成；含硅复合脂质体的含硅的无机前体水解缩合形成无机硅酸盐网 状结构分布于囊泡的表面。荧光两亲性分子的亲水基团掺杂在含硅复合脂质体的 亲水基团之间，构成了脂质双分子层的外层和内层；含硅复合脂质体的疏水脂质 链和荧光两亲分子的疏水长链掺杂排列共同构成了脂质双分子层的内层和外侧 的之间中间层；中间层为包载疏水药物的空间，内层内侧的空腔为包载亲水药物 的空间。

含硅复合脂质体的无机前体含有(EtO)₃Si结构，(EtO)₃Si结构个数为1～3>

荧光两亲性分子中的丙三醇骨架结构优选用单硬脂酸甘油酯(丙三醇与疏水 长链键连而成)。荧光基团优选为甲川菁类荧光染料。

由所述的硅质体纳米粒子药物载体装载药物组成一种具有药物控释功能的硅 质体纳米靶向诊断治疗制剂。装载的药物包括但不限于阿霉素、丝裂霉素、紫杉 醇、喜树碱、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、奥沙利铂、虫草素、伊立替康、 索拉非尼、吉非替尼、莫达非尼、多西他赛、姜黄素、蓝萼甲素、鬼臼毒素。

以下通过具体实施例详述本发明制剂的制备方法及效果，本发明具体实施方 式所列举的实施例只用于说明本发明，并不限制本发明的内容。

实施例1

本发明中所述制剂的一种制备方案如附图1所示，包括以下步骤：

1)甲川菁染料的合成：将结构1与酮类通过Fischer加成制备获得的吲哚啉 结构2，通过取代反应获得结构3和结构4，结构3和含有共振结构的次甲基共 轭链类小分子结构5在氮气保护下分散于乙酸酐中120℃搅拌反应得结构6，结 构6与另一端的吲哚啉结构单体分散于三乙胺中发生取代反应生成结构7，即得 甲川菁类荧光染料7，各化合物结构如图8所示；

具体操作如下：

将0.57g苯肼，1.68ml 3-甲基-2-丁酮和3ml冰醋酸加入50ml圆底烧瓶，加 热搅拌3h得到深黄色油状液体，冷却后用碳酸钾溶液反复洗涤，加入二氯甲烷 旋干获得淡黄色固体2,3,3-三甲基吲哚啉。取1当量的2,3,3-三甲基吲哚啉(图8 中结构2)和1.2当量的碘乙烷加入邻二氯苯在氮气保护下加热至110度回流12 小时，冷却后用丙酮洗涤固体产物，称作产物1(图8中结构4)。另取1当量的 2,3,3-三甲基吲哚啉和1.2当量的6-溴己酸加入邻二氯苯在氮气保护下加热至110℃ 回流12小时，冷却后用乙酸乙酯洗涤固体产物，称作产物2(图8中结构3)。 将产物2,5ml醋酸，5ml醋酸酐和1毫摩尔N-〔5(苯基氨基)-2-4-戊二烯基〕苯胺盐酸盐在氮气保护下加热至120℃回流4小时，冷却后加入乙醚洗涤，然后 甲醇溶解，减压除去溶剂，得到粗产品。再将粗产品中加入10ml三乙胺和10ml 乙醇，再加入产物1，常温搅拌3小时。旋蒸除去溶剂，加入乙醚洗涤，用柱层 析的方式提纯得到目标染料(图8中结构7)。展开剂配方：甲醇：二氯甲烷＝1:10， Rf约为0.2。

以上所述合成路线图如图11。

2)丙三醇骨架结构和染料的偶联：通过化学偶联反应将步骤1)制备的结构7 偶联至丙三醇骨架结构的仲碳，从而将甲川菁类染料修饰到丙三醇类骨架结构上； 进行该步骤过程中需要用高位阻结构化合物保护结构8的伯碳得到结构9，再在 4-二甲氨基吡啶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐催化下通过取代反 应连接到仲碳上的羟基上得到结构10。而后使用三氟乙酸脱保护高位阻结构化 合物得到结构11，再使用酸酐类结构取代剩余的伯碳得到结构12，即得到荧光 两亲性分子，各化合物结构如图9所示。

具体操作为：

称取1g单硬脂酸甘油酯和1.417g4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷溶解于10mL 无水吡啶中，置于振荡器中加热至50度振荡18小时，然后将混合物冷却，倒入 冰水混合物中，用氯仿萃取三次，除去不溶性残渣，用去离子水洗三次，用无水 硫酸钠干燥过滤得到伯碳上羟基被保护的单硬脂酸甘油酯结构。减压除去溶剂， 然后用乙酸乙酯/石油醚＝2:1的展开剂硅胶柱层析提纯，得到所需产物。而后， 将当量比为1:1:0.4:2的羟基被保护的单硬脂酸甘油酯结构，染料，4-二甲氨基吡 啶，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐共同溶解于10ml氯仿，室温搅拌 24小时，减压除去溶剂后，用二氯甲烷/甲醇＝15:1的展开剂柱层析提纯，得到 的产物溶解于10ml氯仿，再缓慢加入25倍当量的三氟乙酸脱去保护基团，得到 的产物和丁二酸酐与4-二甲氨基吡啶以1:5:5的当量比溶解于适量氯仿，室温搅 拌24小时然后用氯化铵水溶液洗涤，用氯仿萃取，过滤后，减压除去溶剂，用 二氯甲烷/甲醇＝15:1的展开剂柱层析提纯得到最终产物，称作产物3(图9中结 构12)。

产物3的核磁数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)，δ11.00(t,J＝7.3Hz,1H)7.37 (t,J＝7.2Hz,1H),4.16(p,J＝7.3Hz,3H),4.08(s,1H),2.79–2.59(m,5H),2.42– 2.20(m,2H),2.02(d,J＝6.8Hz,1H),1.84(s,1H),1.73(d,J＝25.5Hz,2H),1.63(d, J＝8.7Hz,1H),1.44(s,1H),1.33(s,3H),1.34–1.22(m,19H),0.98–0.82(m, 5H).MS理论值1170.48，实验值[M]⁺＝1172.1。

以上所述合成路线图如图12。

3)硅质体的构建：产物3和形成硅质体的复合脂质体以3:7的摩尔比共溶于氯 仿和甲醇的比例为3:1的溶液中。然后在真空旋转蒸发器中除去有机溶剂，得到 所得的脂质薄膜。后真空干燥过夜，在60℃的去离子水中水化约30分钟，涡旋 振荡20分钟，用探针型超声仪在冰浴中进一步超声处理5分钟。则通过水解、 缩合、自组装的方式自然形成结构完整的硅质体。

水解缩合自组装的步骤主要为在37℃孵箱中过夜放置，在这过程中主要有以 下步骤

A、水解：如图2中的(EtO)₃Si结构发生取代反应，转变为硅元素上键连三个>

B、缩合，如图2中的硅元素上键连三个羟基的结构，相邻的硅羟基结构有一部 分羟基之间发生聚合(缩合反应)，形成示意图2所示的致密硅酸盐网络结构。 在以上两部过程中，产物3不发生任何化学反应。

C、自组装，经过水解缩合后的含硅复合脂质体和产物3，由于各自均包含亲水 端(硅羟基结构和酸酐)和疏水端(脂肪链)，因此有机物分子在溶液中自发形 成类似细胞膜结构的双分子层。亲水端向外，疏水端在内，形成类似下图的细胞 膜结构。

4)包载阿霉素：对于盐酸阿霉素的负载,按硫酸铵梯度法方案实施。药物与总 脂质的摩尔比为1:10。以磷酸盐缓冲液为洗脱剂,通过葡聚糖凝胶G-50柱法除去 未包载的阿霉素。得到的产物装入分子截留量为1000kDa的透析袋中，在磷酸 盐缓冲液(0.01M,pH＝7.2-7.4)中透析48h，并不断更换透析液，最终得到纯净 的载药纳米粒子。

实施例2

实施例1制备的制剂的小动物近红外荧光成像效果评价，主要包括如下步骤：

(1)裸鼠皮下瘤模型的建立：将HT-29细胞以每只裸鼠2×10⁶个细胞的量接>

(2)肿瘤大小长到约100mm³时，经尾静脉注射100μL>

成像结果如附图4所示，注射该制剂后，肿瘤部位的近红外信号逐渐增强，并在 8小时近红外荧光信号达到最强，且弥散于整个肿瘤部位，且相对于给药前和传 统脂质体组以及非掺杂硅质体结构组，肿瘤可以更加清晰成像，说明该制剂具有 很好的近红外荧光成像的效果。

实施例3

(1)光热升温稳定性的考察：将等浓度的硅质体纳米颗粒，荧光染料和未掺杂 复合脂质体溶液3ml加入石英比色皿，以808±10nm的波长和2W/cm²的输出功>

(2)结构稳定性的考察：将不同体积比的的非离子表面活性剂曲拉通X-100加 入溶解于PBS和血清中的不同纳米粒子中，37℃孵育，然后用Malvern Zetasizer Nano-ZS90测定纳米粒子的粒径。该实验同样需三次平行实验。

结果如图5所示。

实施例4

该制剂的多重响应型药物控释效果的体外评价，包括pH值敏感性、温度敏感性 和光热敏感性药物控释评价，步骤如下所述：

(1)首先，研究光热敏感性药物控释效果。为了研究光触发的阿霉素释放， 将包载阿霉素的硅质体纳米粒子悬浮在1mL的磷酸盐缓冲溶液中，然后在不同 时间点(0、60、130、200和270min)用近红外光(808nm、2W/cm²)照射10分钟。>

(2)接下来，研究温度和pH触发的阿霉素释放，将阿霉素负载的硅质体 纳米粒子悬浮在1mL的磷酸盐缓冲溶液并调节pH为7.4和5.0并装载在透析 袋内，分别在25、37和41℃下孵育24小时。在1,2,4,8小时的时间点取一定量 透析液测定该时间点的药物释放量。

实验结果如附图6所示，可见在41℃时的药物释放量最大，并且酸性环境 可以一定程度提高药物释放，而在近红外光照射的10分钟内，药物释放量则会 得到迅速提升。综上所述，该硅质体纳米粒子在体内无近红外光照的情况下不 会明显释放，而在有近红外光进行照射的情况下由于有具有光热转换作用的荧 光染料，可以将肿瘤部位温度升高，达到了温度敏感性释放的目的。并且，在 肿瘤的酸性微环境和较高温度下能达到更高的释放比率，该实验说明了该制剂 达到了很好的刺激响应型药物控释效果。

实施例5

该制剂的肿瘤治疗效果评价，主要步骤如下所述：

(1)裸鼠皮下瘤模型的建立：将HT-29细胞以每只裸鼠4×10⁶个细胞的量接>

(2)当肿瘤大小达到约100-120mm³时，将小鼠平均分为5组，每组6只，每>

(3)对于需要光热治疗的实验组，在给药后24h，用波长为808nm的激光照 射肿瘤部位10min，激光功率设定为2W/cm²。

(4)每隔两天用游标卡尺测定肿瘤的长和宽，肿瘤体积近似等于长乘以宽的平 方除以二。

实验如附图7所示，注射磷酸盐缓冲液并加以激光照射的对照组，肿瘤生长迅速；单纯注射阿霉素和单纯注射包载阿霉素的纳米粒子，肿瘤生长受到的抑制很小； 注射没有包载阿霉素的该制剂后给予激光照射，肿瘤被消融掉，但是肿瘤出现复 发；当注射装载有阿霉素的该制剂后给予激光照射后，肿瘤被彻底消融掉，而且 没有出现复发，这说明该制剂具有很好的光热治疗的效果，而且该制剂装载的阿 霉素可以起到防止肿瘤复发的协同治疗的效果。