一种可实现MRI监控和射频消融协同增效的磁性复合诊疗剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种可实现MRI监控和射频消融协同增效的磁性复合诊疗剂及其制备方法和应用，它由担载的固态薄荷醇和多孔中空Fe3O4纳米颗粒构成，通过一种简单的液固相互转变介导灌注法制得。本发明的磁性复合诊疗剂在射频场下，通过以下两个途径增强射频消融，一是内部担载的薄荷醇实现固‑液‑气的三相转变，产生瞬态空化，同时阻断热损失，增强射频消融；二是多孔Fe3O4纳米颗粒产生磁热转变进一步增强射频消融。此外，该磁性复合诊疗剂随着射频进行，多孔中空Fe3O4与水分子交换速率和配位数都显著增加，导致T1加权MRI效果增强，实现射频消融过程监控。本发明中的产品制备条件温和、简单易行、无污染且产量高，适用于工业化大规模生产，临床转化潜力巨大。

说明书

技术领域

本发明属于射频介入治疗、纳米生物医药领域，具体涉及一种集磁热转变和连续空化共同增效射频消融、射频介导空化敏感的T1加权MRI监控射频过程等功能于一体的磁性复合诊疗剂及其制备方法。

背景技术

临床射频消融功率过大，时间过长且血液流动等原因容易造成正常组织热损伤。如若降低射频功率和时间，又容易造成残余肿瘤存在。因此如何在保证治疗效果的前提下，降低射频功率和时间，提高射频消融效率成为目前的研究热点和难点。目前临床上增强射频消融所采用的试剂为无水乙醇，利用其挥发特性产生的空化效果，增强射频消融体积；但是乙醇易扩散、可控性差，且容易带走热量，加速热扩散、热损失。

肿瘤治疗过程的监控是实现肿瘤治疗可控性有效手段之一，特别是针对热消融为代表的可控性较差、潜在副作用大的剧烈物理治疗更为重要。目前大多数研究多涉及影像引导的物理治疗，这些都是利用影像手段先确定肿瘤位置，然后进行治疗，且治疗前后影像信号大都不变，因而无法实现监控消融治疗过程。即使临床超声造影剂引导的射频消融，由于超声分辨率差，且这些产生的造影剂气泡仅能在为发生瞬态空化之前起到增强超声造影效果，在治疗过程中其安全破裂，造影效果消失，也无法起到治疗监控。目前对治疗响应型的影像信号变化监控治疗过程鲜有研究、报道。因此，为提高射频能利用率，降低治疗功率、治疗时间，提高射频消融可控性、安全性，开发出具有基于射频场磁热转化、连续空化、热损耗阻断以及射频过程监控等功能于一体的多功能诊疗剂成为一个技术难点。

发明内容

本发明针对现有射频消融中存在的技术问题，目的在于提供可实现MRI监控和射频消融协同增效的磁性复合诊疗剂及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的磁性复合诊疗剂是以多孔空心Fe₃O₄为载体，内部空腔结构和多孔孔道结构内装载固态薄荷醇分子。本发明选择多孔空心Fe₃O₄为载体，一方面利用其丰富的孔道和大的空腔可装载固态天然薄荷醇，利用固态薄荷醇吸收射频热能后由固态变为液态，并持续地挥发成气态，产生连续的空化效应，伴随的高热、微射流、冲击波等物理作用可以杀死肿瘤细胞，同时薄荷醇也可阻断热量扩散、热损失，进一步提高射频热能利用率。另一方面多孔空心Fe₃O₄其本身可在射频场交变磁场下发生磁热响应，提高射频磁场能利用率。此外，磁性多孔空心Fe₃O₄在射频后T1加权MRI成像增强，可实现薄荷醇连续空化监控以及射频消融监控。该磁性复合诊疗剂集磁热转变和连续空化增强射频消融、抑制的热扩散、热损失和空化、射频过程监控等功能于一体，可有效降低射频消融时间、功率，提高射频能利用率，提高射频消融可控性、安全性，具有重大的临床应用转化前景。

本发明的目的还在于提供上述多功能纳米诊疗剂的制备方法，具体地包括以下步骤：A)1-3g的FeCl₃·6H₂O首先溶解于乙二醇与水混合物中，非磁力搅拌、超声溶解，加入0.5-5g乙酸铵，进一步超声、非磁力搅拌溶解，随后置于水热釜中，高温下水热反应一段时间后，冷却到室温，随后在外界磁铁下收集、并水洗3次，得到多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒；B)将上述得到的50mg-1000mg多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒分散于甲醇溶液中，并加入到50℃-70℃下的0-8g液态薄荷醇中，非磁力搅拌、震荡0.5-8h，以便甲醇充分挥发；C)在上述基础上，加入5-20mL热水(70℃)，以1000-3000rpm高速非磁力搅拌、震荡2-20min，随后静置5-30min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗2-5次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，冷冻干燥都备用。

步骤A中，所述的乙二醇与水混合物中乙二醇体积为70％-100％，用量40mL-80mL；水热反应温度在160℃-220℃之间，反应时间为10h-24h，最后得到的多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒质量在0.2g-0.95g之间。

步骤B中，所述的易挥发性溶剂可为甲醇、氯仿或二氯甲烷，用量1-8mL，非磁力搅拌速度在100rpm-500rpm之间。

步骤B中，所述的薄荷醇包括不仅限于左旋薄荷醇(熔点：32-36℃)，右旋薄荷醇(熔点：42-45℃)和消旋薄荷醇(熔点：41-43℃)。较佳地选择左旋薄荷醇。

步骤A中，制备的多孔中空Fe₃O₄，在射频场下具有磁热转换功能；因此步骤C中得到的包裹该薄荷醇的磁性复合诊疗剂可在射频场下发生磁热转换，提升温度和增强射频消融体积。

步骤B中，所述的薄荷醇，在射频作用下，待温度高于熔点时发生固液相变，进一步依赖其挥发性的优点持续产生气态薄荷醇；因此，步骤C中制备的包裹该薄荷醇的磁性复合诊疗剂在射频作用下可持续地产生薄荷醇气泡，该气泡可以持续地增强超声成像，同时其空化效应还可以增强射频消融。

步骤B中，疏水性质的薄荷醇可阻碍热量扩散、损失；因此，步骤C中制备的包裹该薄荷醇的磁性复合诊疗剂可以阻止热损失，提高射频热的利用率，在射频作用下温度增加更为明显。

步骤C中，制备的担载薄荷醇的磁性复合诊疗剂分散均匀、尺寸200-400nm左右，表面存在乙二醇，电势为-27.9mV，薄荷醇担载量5-17％之间。

步骤C中，收集收集所得到的磁性复合诊所采用的方式为离心和磁铁的磁性分离。

步骤C中制备的包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂因其合成组分都是生物相容性好的材料，因此具有优异的生物相容性和无毒性。

此外，本发明的制备方法简单易行、无污染、污染小、重复性好、产量高，适合工业规模化生产。该纳米诊疗剂可广泛用于多癌症的诊断、治疗，这在医学临床应用中具有非常重要意义。

附图说明

图1是实施例1中制得的多孔空心Fe₃O₄(HIONs)透射电镜图，从中可以看到射频诊疗剂颗粒形貌规整，球形，且均匀分散，尺寸在200-400nm之间。

图2是实施例1中制得的多孔空心Fe₃O₄(HIONs)扫描电镜图，壳层多孔结构，孔道丰富，且颗粒分散均匀。

图3是实施例1中制得的多孔空心Fe₃O₄氮气吸附脱附曲线和孔径分布，从图可以看到纳米颗粒含有丰富孔道，大的比表面积，最可几孔径尺寸25nm。

图4是实施例6中担载薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)动态光散射粒径分布图(a)和表面zeta电势分布图，从中可以看出制得磁性复合诊疗剂的水合动力学直径峰值位于387nm，表面zeta电势最大峰值位于-27.9mV。

图5是实施例6中担载薄荷醇的磁性复合诊疗剂扫描电镜图，壳层多孔结构，且颗粒分散均匀。

图6是实施例1中制得的多孔空心Fe₃O₄和实施例6中担载薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)热重(TG)曲线图。从图薄荷醇的担载量达到14％，

图7是实施例6中射频辐照前后PLGA-LM的光学显微照片，a为射频加热前，b为射频加热后，明显地，在射频加热后的b图上出现微米级别的气泡，说明薄荷醇发生了RSV过程。

图7是实施例6中担载薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)分散于PBS中不同时间的粒径大小，从图中可以看到该磁性复合诊疗剂具有优异的胶体稳定性。

图8是实施例10中PBS、HIONs载体分散液和DLM@HION分散液射频前、后BFI和CHI模式下的体外超声成像图，从图可以看到实施例6中合成的DLM@HION在射频加热后图像衬度和对应的灰度增加值明显比实施例1中HIONs的大很多，表明该磁性复合诊疗剂——DLM@HION射频加热后，发生三相转变产生薄荷醇气泡增强超声成像衬度。

图9是实施例10中PBS、HIONs载体分散液和DLM@HION分散液瘤内注射后，在射频前、后BFI模式下的肿瘤处超声成像图，从图可以看到实施例6中合成的DLM@HION在射频加热后图像衬度和对应的灰度增加值明显比实施例1中HIONs载体的大很多，表明发生了射频响应超声造影成像。

图10是实施例11中在实施例6制得的不同浓度的磁性复合诊疗剂-DLM@HION体外T1加权MRI图片(a)、图片衬度(b)以及纵向弛豫率(c)，可以得到射频后T1加权的MRI图像衬度增加、纵向弛豫率增加，r1值增大。

图11为实施例11中实施例6制得磁性复合诊疗剂-DLM@HION在瘤内注射到4T1乳腺癌中，并在射频前(a)、后(b)的T1加权MRI图片，从图可以看出，射频后T1加权的MRI图像衬度增加。

图12是实施例12中离体猪肝射频消融实验中，在注射实施例6中合成的DLM@HION和实施例1合成的HIONs，并经射频(5w-15s)原位消融后得到的消融区域横截面(a)数码照片以及计算的消融体积(b)，图中DLN@HION获得消融体积最大，说明DLM介导的空化和HION介导的磁热协同增强射频消融。

图13是对比例1中注射实施例6中合成的DLM@HION和实施例1合成的HIONs，并经射频(5w-5s)原位消融后得到的消融区域横截面(a)数码照片以及计算的消融体积(b)，图中DLN@HION获得消融体积最大。

图14是实施例12中，活体射频消融实验中，4T1乳腺癌肿瘤在注射PBS、实施例6中合成的DLM@HION和实施例1合成的HIONs，并经射频(5W-20s)原位消融后得到的消融区域横截面(a)数码照片以及计算的消融体积(b)，图中PLGA-LM获得消融体积最大，说明实施例6中合成的磁性复合诊疗剂射频作用时发生持续地三相转变以及产生的磁热转变，协同增强射频消融体积。

图15是实施例12中，活体射频消融实验中，4T1乳腺癌肿瘤在注射PBS(a1，a2)、实施例1合成的HIONs(b1，b2)和实施例6中合成的DLM@HION(c1，c2)，并经射频(5W-20s)消融过程中温度变化曲线(a1-c1)最大温度的热红外图片(a2-c2)。

具体实施方式

实施例1制备多孔空性Fe3O4纳米载体(HIONs)

1.350g FeCl₃·6H₂O溶解于70mL体积比为80％的乙二醇溶液中，磁力搅拌、超声溶解，加入3.854g乙酸铵，进一步超声、磁力搅拌溶解，随后置于水热釜中，200℃下水热反应16.5小时后，冷却到室温，随后外界磁铁下收集、并水洗3次，得到多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒，即HIONs，如图1至图3所示。

实施例2制备多孔空性Fe3O4纳米载体(HIONs)

2.700g FeCl₃·6H₂O溶解于70mL体积比为80％的乙二醇溶液中，磁力搅拌、超声溶解，加入3.854g乙酸铵，进一步超声、磁力搅拌溶解，随后置于水热釜中，200℃下水热反应16.5小时后，冷却到室温，随后外界磁铁下收集、并水洗3次，得到多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒，即HIONs。

实施例3制备多孔空性Fe3O4纳米载体(HIONs)

2.700g FeCl₃·6H₂O溶解于70mL体积比为70％的乙二醇溶液中，磁力搅拌、超声溶解，加入3.854g乙酸铵，进一步超声、磁力搅拌溶解，随后置于水热釜中，160℃下水热反应20小时后，冷却到室温，随后外界磁铁下收集、并水洗3次，得到多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒，即HIONs。

实施例4制备多孔空性Fe3O4纳米载体(HIONs)

2.700g FeCl₃·6H₂O溶解于70mL体积比为70％的乙二醇溶液中，磁力搅拌、超声溶解，加入3.854g乙酸铵，进一步超声、磁力搅拌溶解，随后置于水热釜中，160℃下水热反应24小时后，冷却到室温，随后外界磁铁下收集、并水洗3次，得到多孔空心Fe₃O₄纳米颗粒，即HIONs。

实施例5制备包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)

将实施例1中得到的400mg多孔空心Fe3O4纳米颗粒分散于4mL甲醇中，并加入到50℃下的4g液态薄荷醇(DLM)中，非磁力搅拌、震荡4h，以便甲醇充分挥发；在上述基础上，加入15mL热水(70℃)，以1200rpm高速非磁力搅拌、震荡4min，随后静置10min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗3次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，即DLM@HION。

实施例6制备包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)

将实施例1中得到的400mg多孔空心Fe3O4纳米颗粒分散于4mL甲醇中，并加入到60℃下的4g液态薄荷醇(DLM)中，非磁力搅拌、震荡4h，以便甲醇充分挥发；在上述基础上，加入15mL热水(70℃)，以1200rpm高速非磁力搅拌、震荡4min，随后静置10min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗3次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，即DLM@HION，如图4至图7所示。

实施例7制备包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)

将实施例1中得到的400mg多孔空心Fe3O4纳米颗粒分散于4mL甲醇中，并加入到70℃下的4g液态薄荷醇(DLM)中，非磁力搅拌、震荡4h，以便甲醇充分挥发；在上述基础上，加入15mL热水(70℃)，以1200rpm高速非磁力搅拌、震荡4min，随后静置10min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗3次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，即DLM@HION。

实施例8制备包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)

将实施例1中得到的400mg多孔空心Fe3O4纳米颗粒分散于8mL甲醇中，并加入到60℃下的4g液态薄荷醇(DLM)中，非磁力搅拌、震荡4h，以便甲醇充分挥发；在上述基础上，加入15mL热水(70℃)，以2000rpm高速非磁力搅拌、震荡4min，随后静置10min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗3次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，即DLM@HION。

实施例9制备包裹薄荷醇的磁性复合诊疗剂(DLM@HION)

将实施例1中得到的400mg多孔空心Fe3O4纳米颗粒分散于4mL甲醇中，并加入到60℃下的4g液态薄荷醇(DLM)中，非磁力搅拌、震荡4h，以便甲醇充分挥发；在上述基础上，加入15mL热水(70℃)，以3000rpm高速非磁力搅拌、震荡4min，随后静置10min，吸取掉上层为包覆的液态薄荷醇，最后水洗3次，收集所得到的磁性复合诊疗剂，即DLM@HION。

实施例10体外、活体超声成像

体外超声成像：无粉塑胶手套小拇指中加入3mL脱气PBS、3mL分散于脱气PBS的实施例1制得的HIONs载体分散液(5.0mg/ml)以及3mL分散于脱气PBS的实施例6中制得的磁性复合诊疗剂(DLM@HIONP)分散液(5.8mg/m1)，除去气泡，密封，并将该滴管置于大的水槽中，射频针直接置于水槽中进行加热，在加热前、后分别进行B基波模式下(BFI)和造影谐波(CHI)模式下的超声成像，获取图像。超声探头距离一地性滴管距离为2.8em，机械指数0.6(BFI)和0.03(CHI)。如图8所示。

活体超声成像：皮下接种有小鼠乳腺癌4T1雌性裸鼠3组，分别向4T1肿瘤中注射0.1ml PBS、对比例1制得的(5mg/m1)HION分散液以及实施例6制得的DLM@HIION(5.8mg/ml)分散液以及一个不做任何处理的对照组，随后肿瘤处穿入射频针，在射频辐照开始前超声造影，同时20s射频辐照后进行BFI模式下的超声成像，机械指数为0.6，射频辐照的功率为5W。如图9所示。

实施例11体外、活体层面T1加权的MRI

体外T1加权的MRI成像：参照实施例10中体外超声成像实验流程，进行不同浓度的T1加权的MRI实验。将实施例6制得的DLM@HION分别配置成Fe摩尔浓度为0mM、0.1mM、0.2mM、0.25mM的分散液，取每个浓度的DLM@HION分散液1ml分别置于2ml的EP管中，随后进行T1-加权的MRI。

活体T1加权的MRI成像：参照实施例10中活体超声成像实验流程，皮下接种有小鼠乳腺癌4T1雌性裸鼠3组，分别向4T1肿瘤中注射0.1ml PBS、对比例1制得的(5mg/ml)HION分散液以及实施例6制得的DLM@HIION(5.8mg/ml)分散液以及一个不做任何处理的对照组，随后肿瘤处穿入射频针，进行5W-20s的射频辐照，射频辐照前、后分别进行T1加权的MRI如图10-11所示。

实施例12离体、活体射频消融增效

离体猪肝射频消融：脱气离体猪肝，向其中分别注射0.3ml的PBS、对比例1中制得的HIONs载体(5mg/ml)以及实施例1中制得的DLM@HION(5.8mg/ml)分散液，然后将射频针插入到注射的位置后进行射频消融(5W-15s)，之后解剖切片，截取横截面积最大的一面量取长(L)、宽(W)，后根据公式L×W²/6计算消融体积。每个样品重复三次，取平均值。

活体肿瘤实验：皮下接种有4T1乳腺癌的雌性裸鼠，向4T1肿瘤中分别注射0.1mlPBS、对比例1中制得的HIONs载体(5mg/ml)以及实施例1中制得的DLM@HION(5.8mg/ml)分散液，随后肿瘤处穿入射频针，进行射频辐照，功率为5W，辐照时间20s，过程中进行热红外成像记录温度变化。之后，解剖肿瘤并切片，截取横截面积最大的一面量取长(L)、宽(W)，后根据公式L×W²/6计算消融体积。每个样品重复三次，取平均值。

如图12、图14和图15所示，图中DLN@HION获得消融体积最大，说明DLM介导的空化和HION介导的磁热协同增强射频消融；PLGA-LM获得消融体积最大，说明实施例6中合成的磁性复合诊疗剂射频作用时发生持续地三相转变以及产生的磁热转变，协同增强射频消融体积。

对比例1

参照实施例12中离体猪肝射频消融实验流程，射频功率为5W，射频时间5s，其他流程与实施例12中离体猪肝射频消融实验流程一致。如图13所示。