一株防治稻瘟病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株防治稻瘟病的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其应用，属于微生物技术领域。本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E69，包括：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年9月5日，保藏编号为CGMCC NO.16427。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69能够防治水稻稻瘟病，开辟了贝莱斯芽孢杆菌相关应用的新领域，对水稻稻瘟病有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高，其对我国南方和北方不同品系的水稻均有很好的稻瘟病防治效果，能够更大限度的降低水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株防治稻瘟病的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻是全世界一半以上的人口所依赖的主食，水稻产量占据世界粮食总产量的1/4以上，中国粮食总产量一半以上。稻瘟病(RiceBlast)是由子囊菌Magnaporthe oryzae(T.T.Hebert) Yaegashi&Udagawa(无性态：Pyricularia oryzae)引起的一种突发性强、易于流行的真菌病害、分布广泛，全球85个国家均有发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等，在全球每年造成10-30％的水稻产量损失。

稻瘟病菌孢子是稻瘟病主要的侵染器官，孢子成熟后产生芽管，附着胞附在水稻表面，芽管以自然孔口或以侵染栓从水稻表皮直接进入。其中，附着胞的形成是成功侵入的关键步骤，产生足够的压力才能够机械穿透寄主角质层完成侵入过程，而黑色素就是产生附着胞压力的前提，附着胞与寄主表面接触一侧非常小的区域内沉积黑色素，最后形成附着胞孔，完成侵入过程。芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，同稻瘟病菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌菌丝生长、分生孢子的萌发、使附着胞畸形和淡化黑色素，同时诱导水稻防御系统抵御稻瘟病菌的入侵，从而达到生防的目的。

芽孢杆菌(Bacillus)能够有效控制植物病害，同时对人畜安全、植物病原菌不易产生抗性、抗逆性强和促进植物生长，是稻瘟病防治上的重要生防菌。芽孢杆菌定殖在水稻植株上，产生抗菌活性物质抑制稻瘟病菌的生长，诱导水稻产生抗病性，对水稻植株具有促生作用，可以挽回水稻产量损失。芽孢杆菌在水稻产业的可持续发展中对稻瘟病的生物防治具有指导意义，菌可以在化学农药不能施用的时期防治稻瘟病的突发危害，最大限度减轻稻瘟病造成的产量损失，不会增加水稻有毒物质残留，更不会污染环境。

芽孢杆菌可以产生几丁质酶、糖脱酶、细胞壁降解酶等促使稻瘟病菌菌丝细胞壁溶解，特别是那些衰老的甚至接近死亡的菌丝更容易发生溶解。宗英等(2017)分离的贝莱斯芽孢杆菌JS25R发酵液显著抑制禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)的生长。杨可等(2018)分离的贝莱斯芽孢杆菌 TCS001对黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制率达87.66％，发酵滤液致使黄瓜灰霉病菌孢子芽管中间或顶端膨大畸形。孙平平等(2018)分离的贝莱斯芽孢杆菌L1对梨灰霉和青霉病菌(Penicillium)的抑菌效果分别为 92.88％和77.47％，能引起病原菌菌丝膨大、畸形。目前还未见到有关贝莱斯芽孢杆菌防治稻瘟病的研究报道。

利用酶工程和蛋白质工程技术，开展农作物近采收期以蛋白质为有效成分的新型芽孢杆菌生防制剂的研究与应用，可以最大限度地降低水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。芽孢杆菌防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足联合国世界粮食组织关于粮食安全发展的要求，但是本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有广谱且高效防菌、抗菌活性物质产量高的芽孢杆菌菌株。

发明内容

为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一株对水稻稻瘟病有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌菌株。

根据本发明的一个方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) E69，包括：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏日期为2018年9月5日，保藏编号为CGMCC NO.16427。

根据本发明的另一个方面，提供一种菌剂，包含贝莱斯芽孢杆菌E69。

根据本发明的又一个方面，提供一种防治稻瘟病的方法，包括贝莱斯芽孢杆菌E69或贝莱斯芽孢杆菌E69菌剂施用于水稻作物。

可选择地，贝莱斯芽孢杆菌E69菌剂为贝莱斯芽孢杆菌E69的培养液。

可选择地，稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟或谷粒瘟中的一种或几种。

根据本发明的再一个方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌E69或贝莱斯芽孢杆菌E69菌剂在防治稻瘟病中的用途。

可选择地，稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟或谷粒瘟中的一种或几种。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69属于水稻内生菌，能够防治水稻稻瘟病，开辟了贝莱斯芽孢杆菌相关应用的新领域。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69对水稻稻瘟病有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69对水稻稻瘟病具有广谱且高效防菌、抗菌能力，其对我国南方和北方不同品系的水稻均有很好的稻瘟病防治效果，能够更大限度的降低水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69对水稻促生、促产效果较好。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌E69对多种植物病原菌具有良好的拮抗作用。

保藏信息

本发明分离鉴定的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E69，已于2018年9月5日日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.16427。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69菌株在LB培养基平板上的培养形态。

图2是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69菌株与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

图3是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69与多种植物病原菌的平板对峙图片。

图4是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69发酵培养液对稻瘟病菌侵染结构抑制的图片。

图5是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69无菌上清液抑制后的稻瘟病菌菌丝和分生孢子的图片。

图6是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69在水稻茎部的定殖图片。

图7是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69菌株的生防活性物质检测图片。

图8是本发明的贝莱斯芽孢杆菌E69产生的挥发性物质对稻瘟病菌P131 的抑制图片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征向量可以相互任意组合。

实施例1

贝莱斯芽孢杆菌E69菌株的分离及筛选方法如下：

(1)样品采集：采集样品为水稻品种宁粳50号，地点为宁夏回族自治区灵武市梧桐树乡，连同水稻的根系一起拔出，用采集袋装好，放在冰盒中带回实验室分离。

(2)分离方法：选取健康水稻植株根、茎和叶片，称取1g，放入1％次氯酸钠浸泡10min，70％酒精中浸泡1min，加入无菌水反复清洗(至少 10次)。取最后一次冲洗液100μL涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)平板上，28℃恒温培养箱中培养72h，检测表面消毒效果。表面消毒后的根、茎和叶段在无菌研钵中磨成匀浆(加入少量无菌水)，然后梯度稀释，吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基平板上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h。挑取单菌落，在NA固体培养基平板上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于40％甘油中，于﹣80℃超低温冰箱中保存备用。

(3)芽孢杆菌的筛选：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131 菌饼，生长4d后在菌饼两侧相距2cm处接种芽孢杆菌菌饼(5mm)作对峙培养，设置空白对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。 2d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。

肉汤培养基(NA)：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂 15.0g，pH 7.3±0.1，121℃灭菌20min。

番茄燕麦培养基：燕麦片30g，加水1000mL，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后，加入150mL番茄汁，加水补足1000mL，加琼脂粉17-20g后分装灭菌(121℃，20min)。

经鉴定，该贝莱斯芽孢杆菌菌株特征如下：淡黄色，不透明，有皱褶，菌落外缘不整齐。细胞为革兰氏阳性菌，杆状，0.5μm×(1.5～3.5)μm，呈短链或念珠状排列，靠鞭毛运动。芽孢椭圆形， 0.8-(1.1)-1.3μm×2.3-(3.0)-4.2μm，中生，末端膨大为孢子囊。

发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2018年9月5日，保藏编号为CGMCC NO.16427。

实施例2

贝莱斯芽孢杆菌E69菌株的生物活性测定：

(1)芽孢杆菌E69发酵培养液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，菌饼两侧相距3cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入芽孢杆菌的发酵液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图2。

(2)芽孢杆菌E69无菌上清液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，菌饼两侧相距3cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入芽孢杆菌的无菌上清液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图2。

LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL， pH7.4-7.6，121℃灭菌30min。LB固体培养基：在液体培养基基础上加入15 g琼脂粉。

菌株无菌上清液的制备：将已活化24h的供试菌株E69单菌落分别接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm/min振荡培养72h后，发酵培养液在4℃、 10000rpm/min离心20min去除菌体，上清液经过滤(0.22μm)除菌，即得无菌上清液。

表1芽孢杆菌E69菌株与稻瘟病菌的对峙培养

注：表中的实验数据为三次重复的平均值±标准误。

(3)芽孢杆菌E69菌株在温室盆栽条件下的生防效果：挑选健康水稻品种G19，1％次氯酸钠溶液消毒10min，70％酒精浸泡1cm，无菌水冲洗5 次，28℃人工气候箱催芽，待芽长到1cm时播种于塑料小水桶里(水桶底部直径18cm×高21cm×水桶上部直径24.5cm)。种植28d后喷施待测芽孢杆菌发酵液，芽孢浓度为1×10⁸CFU/mL，每个水桶喷施20mL，每个处理4>6CFU/mL。7d>

稻瘟病叶瘟室内调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准 (表2)(枯草芽孢杆菌等生物农药对寒地水稻稻瘟病的防治效果.农药, 52(2):132-135，2013.)。

表2为稻瘟病叶瘟室内调查分级标准

生防效果计算公式：

表3芽孢杆菌E69在温室条件下对叶瘟的防治效果测定

处理病情指数防治效果(％)E693.71±1.05b83.24±1.15a三环唑4.88±1.14b77.91±1.43b绿地康3.42±0.52b84.51±0.69a清水对照22.09±2.43a/

注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

(4)芽孢杆菌E69菌株的田间防治效果试验

在宁夏回族自治区平罗县姚伏镇小店子村金富源合作社和宁夏穗丰种业有限公司水稻种植基地进行芽孢杆菌E69的田间药效试验，试验菌株芽孢量是1×10⁸CFU/mL，平均每个试验小区面积是50m²，4个重复小区，分别调查芽孢杆菌E69对叶瘟和穗颈瘟的防治效果。

调查方法按《农药田间药效试验准则》，稻瘟病叶瘟调查分级标准是：0 级：无病；1级：仅有针尖大小的褐点；3级：小而圆以致稍长的褐色坏死灰斑，直径1-2mm；5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10％；7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为26％-50％；9级：全面叶片死亡。

穗颈瘟调查分级标准，0级：无穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟；1级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数＜5％；2级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为6％-10％；3级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为11％-20％；4级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为 21％-30％；5级：有穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为21％-30％；6级：穗颈瘟造成瘪粒数＞80％。结果见表4。

生防效果计算公式：

表4芽孢杆菌E69菌株对稻瘟病的田间防治效果

注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。水稻品种为宁粳47号。

(5)芽孢杆菌E69菌株对水稻秧苗的促生能力：选取健康且长势一致的水稻种子D10放入芽孢杆菌E69的发酵培养液中浸种1h后取出放在铺有滤纸的培养皿内，在28℃，RH为70％的人工气候箱培养，48h后调查种子露白数量。每个处理重复3皿。取健康且长势一致的水稻种子放入芽孢杆菌 E69的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，生长1个月后调查水稻秧苗的根长和株高，结果见表5。

表5芽孢杆菌E69对水稻秧苗的促生能力

注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

(6)芽孢杆菌E69菌株对多种植物病原菌的拮抗作用：

在PDA培养基平板上中央放置尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf.sp.niveum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeospoioides)、苹果叶枯病菌(Alternaria alternate)、海棠叶枯病菌(A.alternate)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)、草莓叶枯病菌(A.alternate)、小麦立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌饼(1cm)，分别在菌落边缘两侧相距2cm处接种芽孢杆菌E69(划线2mm)，置于培养箱28℃黑暗培养，5次重复。2-5天后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表6。

表6芽孢杆菌E69菌株对多种植物病原菌的拮抗作用

(7)芽孢杆菌E69菌株对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：

菌株E69发酵培养液对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：培养72h的供试菌株发酵培养液与稻瘟病菌P131孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)以1∶1的比例混匀，混合液在2mL无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用激光共聚焦显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见图4。

菌株E69无菌上清液对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：培养72h的供试菌株无菌上清液与稻瘟病菌P131孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)以1∶1的比例混匀，混合液在2mL无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用激光共聚焦显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见图5。

(8)芽孢杆菌E69菌株在水稻植株上的定殖：

挑选健康且长势一致的水稻种子G19，用1％次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗5遍，28℃催芽2d。将自然土、鸡粪、草炭和营养土按照5∶1∶ 1∶1的比例混匀后灭菌。盆栽用的营养钵(底部直径15cm×高20cm)用 1％次氯酸钠溶液和75％的酒精消毒后，每个营养钵播种10粒发芽水稻种子。种植后25d时，进行叶面和叶背均匀喷雾贝莱斯芽孢杆菌GFP-E69发酵液，每个营养钵水稻植株喷雾5mL，芽孢浓度是1×10⁸CFU/mL。每个处理设18>

(9)芽孢杆菌E69菌株生防活性物质检测：

淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含有0.2％可溶性淀粉的LB平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色10min，用70％乙醇洗板，能产生淀粉酶的菌株，在黑色的背景下，其菌落生长处周围可形成无色的透明圈，如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理 3个重复，结果见表7。

蛋白酶的检测：将活化的待测菌株穿刺接种于1％脱脂牛奶琼脂平板上， 30℃培养24、48、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有蛋白酶的产生，每个处理3个重复，结果见表7。

葡聚糖酶检测：待测菌接种于含有ABP培养基的平板上，30℃培养48、 72h后，观察平板中是否出现消解圈，若有消解圈产生则表明有葡聚糖酶的产生，每个处理3个重复，结果见表7。

嗜铁素检测：嗜铁素用CAS培养基检测，将活化的待测菌接种于CAS 检测培养基平板上，30℃培养72h后，观察平板中是否产生橘黄色晕圈，若出现橘黄色则表明有嗜铁素的产生，每个处理重复3次，结果见表7。

纤维素酶的检测：将分离到的菌株活化后接种于纤维素筛选培养基平板上，28℃恒温倒置培养2d，用0.1％的刚果红染色液浸染10min，再用1mol/L 的NaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶，则会在菌落周围出现清晰的透明圈，每个处理重复3次，结果见表7。

挥发性物质的检测：在番茄燕麦培养基平板中央接种一片直径1cm的稻瘟病菌P131菌块，在另一个同样大小的NA培养基平板上涂布培养E69菌株，将前者反扣于后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以未涂布E69菌株的NA平板作空白对照，于28℃下恒温培养6d后，分别测量涂布E69菌株和对照培养的稻瘟病菌菌落直径，计算相对抑制率。每个处理5个重复，结果见表7和图8。

ABP培养基的制作：用研钵将块状茯苓研碎成粉末，使其可通过120目的筛子，KH₂PO₄>2PHO₄·12H₂O>2O>

CAS培养基的制备：酪胨9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1L水中。

纤维素富集培养基(1L):NaCI 6g,MgS0₄>2P0₄>2>4)S0₄>2HP0₄>

刚果红染色液:用蒸馏水溶解刚果红，终浓度为0.1％(w/v)。

刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCI溶液。

表11芽孢杆菌E69菌株生防活性物质检测

注：数据为三次重复的检测结果；“+”是检测出结果，“-”是未检测出

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。