一种C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱及其合成方法

摘要

本发明公开了一种C3‑芳香型吡咯并吲哚类生物碱及其合成方法。该类化合物具有体外抗神经损伤活性。通过将nascB‑P450基因以及菠菜来源的电子传递系统Fd/FdR共同转化到改造过的新型抗溶菌大肠杆菌GB05dir‑T7中的方法构建全菌催化系统，实现了将含有色氨酸的环二肽底物催化转化为不同区域/立体选择性的多种二聚产物，该方法操作简单，催化效率高，所得目标产物光学纯度高，后处理简单，环保安全性好。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱及 其酶催化合成方法。

背景技术

吡咯并吲哚生物碱是一大类重要的活性天然产物，这大类化合物普遍具有优 良的生理活性，如抗菌，抗肿瘤，抗疟原虫和胆碱酯酶抑制活性等，部分重要成 员也被广泛的用于临床，如：治疗青光眼和胃动力障碍的physostigmine和抗阿 尔茨海默病的posiphen等；因此一直以来都是药物化学，天然产物化学和有机 化学领域中研究最多的天然产物家族之一。结构上，吡咯并吲哚核心骨架由一个 吡咯和吲哚环在2，3位形成的一个稠合的并环结构；根据C3-位取代基的不同， 可以分为简单取代(包括无取代基，羟基取代、异戊烯基和甲基取代)和芳香取 代(主要为含色氨酸基团)两大类型。其中芳香类型由于为数最多，生物活性最 为广泛，对其的化学和生物学研究也是这大类天然产物中最为活跃和重视的。

通过化学合成构建特殊的分子骨架是进行药学研究的重要保障，然而由于吡 咯并吲哚中存在一个邻位的C3季碳和C2叔碳手性中心，因此其化学合成极具 难度。手性季碳中心由于四周的取代基都为化学惰性的碳原子，难以通过简单的 碳碳键的搭建进行构建，并且立体专一性的控制手性中心的形成还需要使用合适 的手性催化剂或手性底物来诱导；由于绝大部分的手性催化剂异常复杂，能获得 对映体光学纯度不高(e.e.～90％)，需要大量实验筛选以及后续进一步纯化，才 能获得光学纯的对映体。也正是由于这些原因，构建手性季碳中心一直以来都是 有机化学中最为困难的反应之一。目前尽管已有少数C3-芳香型吡咯并吲哚生物 碱被化学全合成，但是由于需要立体专一性的构建C2-C3叔碳、季碳手性中心， 因此合成路线都很复杂且收率低下；缺乏高效、简单，统一的方法去构建分子骨 架及创造其结构多样性。

酶催化反应以其高度区域、立体选择性，以及操作简单、环保安全以及可重 复利用等优异的性质，成为工业合成的一个非常瞩目的方面。但是由于C3-芳香 型吡咯并吲哚类生物碱结构的特殊性，且酶催化反应具有较高的专一性，按照传 统方法，从酶库中随机筛选获得能够用于骨架合成的酶具有很高的挑战性。因此， 一种更为可行的思路是通过研究这类天然产物的生物合成机制，从中寻找到合成 分子骨架的酶，在此基础上利用酶催化反应，实现分子骨架高效合成和结构多样 化。虽然目前简单取代的吡咯并吲哚生物碱的生物合成机制比较清楚，但是芳香 型的生物合成机制大部分还未曾揭示,仅C3-C3’偶联型吡咯并吲哚的生物合成机 制被解析；其他的如C3与5’，6’，7’位或N原子链接的分子骨架的形成还未 有报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱，该类化合 物具有体外抗神经损伤功能，具有潜在药用价值。

本发明的目的之二在于提供一种酶催化合成C3-芳香型吡咯并吲哚类生物 碱的方法，该方法操作简单，催化效率高，所得目标产物光学纯度高，后处理简 单，环保安全性好。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱，为NAS-1-NAS-30，其结构式如下：

第二方面，提供一种酶催化合成C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱的方法，包 含如下步骤：

1)将N-Boc-色氨酸类似物(I)与另一分子氨基酸甲酯(II)经缩合反应得 到中间体(III)；所得中间体(III)经过脱除叔丁氧羰基及分子内酯的胺解反应 形成含有色氨酸的环二肽底物(IV)；

2)含有nascB-P450基因以及菠菜来源的电子传递系统Fd/FdR的质粒构建 以及改造抗溶菌大肠杆菌GB05dir-T7；

3)将构建好的含有nascB-P450基因以及菠菜来源的电子传递系统Fd/FdR 的质粒共同转化到改造过后的抗溶菌大肠杆菌GB05dir-T7中，用全菌催化的方 法催化环二肽底物(IV)形成不同区域/立体选择性的二聚产物(V)和(VI)；

该方法采取以下合成路线：

上式中：

式(I)、式(III)、式(IV)、式(V)和式(VI)中，R3代表氢，卤素； 式(II)代表20种天然氨基酸的甲酯,其中R1和R2为20种天然氨基酸上а位 上的取代部分；式(V)和式(VI)代表不同区域/立体选择性的环二肽二聚产物。

优选地，上述步骤2)中所述的nascB-P450基因来源于斐济海底的链霉菌Streptomyces sp.CMB-MQ030，并在金斯瑞生物科技有限公司，利用Optimum GeneTM算法，进行大肠杆菌优化表达基因的合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，通过NdeI-XhoI两个酶切位点构建在pET21a质粒上，形成nascB-P450 -pET21a；菠菜来源的电子传递系统Fd/FdR经过与上述nascB-P450相同的大肠 杆菌密码子优化后，Fd和FdR的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示，Fd 基因通过NcoI-HindIIII酶切位点构建到pRSF-Duet上，随后将FdR基因通过 NdeI-XhoI酶切位点构建到该pRSF-Duet的另一多克隆微位点区，形成 pRsf-Dute-Fd/FdR；

步骤2)中改造抗溶菌大肠杆菌GB05dir-T7的方法如下：

首先，以BL21菌液为模板，用T7-for/T7-rev引物对(SEQ ID NO:4-5)进 行PCR得到T7-RNA聚合酶基因片段；以质粒pIB139为模板，用Am-for/Am-rev 引物对(SEQ ID NO:6-7)进行PCR得到Am(安普霉素)抗性基因片段，然后 将这两个片段回收之后，以这两个片段为模板，用T7-for/Am-rev引物对PCR获 得全长片段；取出低温保存的菌种GB05-dir(该菌通过将RecET基因整合到DH10B的基因组上得到的，具体参见Jun Fu etal,Full-lengthRecEenhances linear-linear homologous recombination and facilitates directcloning for bioprospecting,Nature Biotechnology,30(5):440-446.)，然后在LB固体培养基平 板上划线，37℃培养过夜；挑取单一菌落于5mL LB液体培养基中，37℃， 220rpm，培养过夜；接种1mL菌液转接至100mL新鲜的LB液体培养基中， 同时加入1mL 1M阿拉伯糖，37℃220rpm培养，当OD 600值达到0.6～ 0.8时，将锥形瓶从摇床中取出，冰浴25min，并且不时缓慢摇匀以保证菌液充 分冷却；然后将菌液转移至提前预冷的50mL离心管中，4℃，4000rpm， 离心10min，倒掉培养基，收集菌体；先加入1mL预冷的无菌水，用枪尖轻 轻吹打，充分重悬菌体，再加入20mL预冷的无菌水，4℃，4000rpm，离 心10min，弃去上清，收集菌体；重复上述步骤一次，然后再用20mL冰冷的 10％甘油洗涤两次；最后重悬于2mL冰冷的10％甘油中。将重悬的菌体分装 到预冷的1.5mL离心管中(50-100μL每管)；将装有菌体的离心管用液氮速冻， 然后放入-80℃冰箱保存；取一管感受态，然后加入5μL的PCR产物，轻轻混匀，转入预冷的1mm的电转化杯，将电转杯的外部擦干，然后将电转杯放进 电转仪，设定参数：电压1.8kV，时间5ms，电转杯间距1mm，启动对细胞 的电脉冲，电击结束后，迅速取出电转杯，向电转杯中加入1mL LB液体培养 基；用移液枪将细胞转移至灭菌的1.5mL离心管中，于37℃220rpm复苏 1h，然后离心，倒掉多余的培养基，用剩下的培养基重悬菌体，将菌体均匀涂 布在含Am抗生素的LB固体平板上，37℃培养过夜；挑取多个单一菌落于5 mL LB液体培养基中(含Am抗生素)，37℃，220rpm，培养过夜；然后以菌 液为模板，用T7-for/Am-rev引物对进行PCR，得到3576bp的条带即为重组菌 株GB05dir-T7。

优选地，步骤3)具体实施如下：将pRsf-Dute-Fd/FdR和nascB-P450-pET21a 共转化到重组菌株GB05dir-T7中，于37℃培养过夜，挑取单克隆至5mL含有 5μL Amp、5μL Am、5μL Km的LB中于37℃，220转下培养过夜，并转至500mL 的LB培养基(含有0.5mL Amp、0.5mLAm、0.5mL Km)中，37℃220rpm培 养，当OD 600值达到0.8～1.0时，将锥形瓶从摇床中取出，降温至18℃，加 入0.5mL ALA，0.5ml Fe²⁺(0.2mM>4)，100μL>

第三方面，提供上述C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱在制备抗神经损伤药物 中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明通过合成一系列含有色氨酸的环二肽底物，结合一步生物酶催化的合 成途径，利用酶的高度立体选择性来催化一系列不同区域/立体选择性的C3-芳 香型吡咯并吲哚类生物碱，得到的产物具有体外抗神经损伤活性，具有潜在药用 价值。该方法原料易得、成本低、避免金属催化剂及大量有机试剂的应用，绿色 环保，便于大规模生产C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱，解决了现有技术通过手 性拆分造成原料浪费的难题，且相对于金属催化，所有涉及到的催化用酶简单易 得，环保安全，操作简单，可应用于大规模工业生产。

附图说明

图1为用全菌催化的方法催化环二肽底物(IV)形成不同区域/立体选择性的二 聚产物(V)和(VI)的反应路线图。

图2为二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测表达相关蛋白的电 泳图。图中泳道1到泳道8蛋白分别为:Marker；NascB,44Kda；GDH,30.6kDa； FdR,80.3kDa；Fd,31.3kDa。

图3为nascB-P450酶体外催化W_L-A_L和其它环二肽底物反应的液相数据>L-A_Land>L-V_L,(b)cW_L-A_L and>L-I_L,(c)cW_L-A_L and>L-L_L,(d)>L-A_L and>L-M_L,(e)cW_L-A_L and>L-F_L。

图4为nascB-P450酶体外催化cW_L-P_L和其它环二肽底物反应的液相数据：>L-P_Land>L-A_L(a),cW_L-P_L and>L-I_L(b),cW_L-P_L and>L-M_L(c),cW_L-P_L and>L-V_L(d),cW_L-P_L and>L-L_L(e)and>L-P_L and>L-F_L(f)。

图5为nascB-P450酶体外催化cW_L-V_L和其它环二肽底物反应的液相数据：>L-V_Land>L-I_L(a),cW_L-V_L and>L-M_L(b),cW_L-V_L and>L-Y_L(c),cW_L-V_L and>D-P_L(d),cW_L-V_L and>L-L_L(e),cW_L-V_L and>L-F_L(f)and>L-V_L and>D-P_D(g)。

图6为nascB-P450酶体外催化所有底物自身二聚液相结果图：cW_L-P_L(a),>L-A_L(b),cW_L-V_L(c),7-Cl-cW_L-P_L(d)and>L-P_L(e)。

图7a为化合物NAS-10的HRESIMS图；

图7b为化合物NAS-10的¹H>

图7c为化合物NAS-10的¹³C>

图7d为化合物NAS-10的HSQC图；

图7e为化合物NAS-10的HMBC图；

图7f为化合物NAS-10的ROSEY图。

图8a为化合物NAS-11的HRESIMS图；

图8b为化合物NAS-11的¹H>

图8c为化合物NAS-11的¹³C>

图8d为化合物NAS-11的HSQC图；

图8e为化合物NAS-11的HMBC图；

图8f为化合物NAS-11的ROSEY图。

图9a为化合物NAS-12的HRESIMS图；

图9b为化合物NAS-12的¹H>

图9c为化合物NAS-12的¹³C>

图9d为化合物NAS-12的HSQC图；

图9e为化合物NAS-12的HMBC图；

图9f为化合物NAS-12的ROSEY图。

图10a为化合物NAS-27的HRESIMS图；

图10b为化合物NAS-27的¹H>

图10c为化合物NAS-27的¹³C>

图10d为化合物NAS-27的HSQC图；

图10e为化合物NAS-27的HMBC图；

图10f为化合物NAS-27的ROSEY图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的 实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】环二肽底物的合成

例1-1、L-Trp-L-Gln的合成

合成路线如下：

氮气保护下，在事先烘干的250mL圆底烧瓶中加入谷氨酰胺甲酯100mg(0.46mmol，1.0equiv)，60mL无水二氯甲烷，降温至0℃，同时缓慢滴加三乙 胺0.28mL(2.06mmol，4.5equiv)，之后加入HOBt.H₂O>

在事先烘干的100mL圆底烧瓶中加入用20mL无水二氯甲烷溶解的中间体 1，降温至0℃，同时缓慢滴加1ml三氟乙酸，之后升至室温反应4h。反应结束 后。减压蒸馏除去溶剂及三氟乙酸，并用5ml甲醇溶解，降温至0℃后，逐滴加 入1ml氨水溶液。之后升至室温反应10h，过滤得到析出的固体即为产物环二肽 底物cW-N(11)。

利用上述例1-1所述方法，合成了以下31个环二肽底物：

【实施例2】关于nascB-P450基因的分子克隆及蛋白表达操作

例2-1、编码nascB-P450酶的基因的获得

通过基因组测序以及分析CMB-MQ030的基因组，鉴定出同时具有CDPS 和nascB-p450基因(SEQ ID No.1)的基因簇来源于斐济海底的链霉Streptomyces sp.CMB-MQ030，并在金斯瑞生物科技有限公司，利用Optimum GeneTM算法， 通过NdeI和XhoI两个酶切位点将合成得到如SEQ ID No.1所示的碱基序列构建在 Pet28a上，获得携带有编码nascB-P450基因的pET28a质粒，即nascB-P450-pET28a。 例2-2、表达nascB-P450酶工程菌的获得

取1μL nascB-P450-pET28a质粒加入到放在冰上的入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中，冰浴30min后于42℃下热击90s，之后放在冰上冰浴2min，加 入1ml LB培养基，置于37°下培养，1h后涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗生 素的LB选择性平板上，37℃倒置培养12小时，挑取单克隆，37°下在加入卡 那霉素抗生素的的LB长起来的即为表达nascB-P450酶所需的工程菌。

例2-3、酶的纯化

上述例2-2培养的菌体6000rpm，4℃离心10分钟，菌体重悬于15mL破菌 缓冲液(25mM HEPES，pH 7.5，300mM NaCl，5mM咪唑，10％甘油)，超 声破菌，细胞裂解液12000rpm，4℃,离心60分钟。按照每1L菌液用2mL Ni-IDA琼脂糖树脂的比例加入1.6mL Ni-IDA琼脂糖树脂于细胞裂解上清液 中，4℃结合1小时。蛋白树脂结合物在重力作用下用不同浓度的咪唑缓冲液A (25mM HEPES，pH 7.5，300mM NaCl，10％甘油)洗脱，收集洗脱液，用 12％SDS-PAGE胶检测蛋白大小及纯度，将纯度大于90％的蛋白缓冲液合并并 回收。纯化之后的nascB-P450酶，按照GE Healthcare公司的操作说明，用PD-10 的凝胶柱换到蛋白保存缓冲液B(25mM HEPES，pH 7.5，50mM NaCl，10％甘 油)，然后用10KDa(GE Healthcare)超滤管浓缩，之后用液氮速冻保存在-80℃， 得到目标的P450酶(SEQ ID NO:8)。

菠菜来源的电子传递系统Fd/FdR经过与上述nascB-P450相同的大肠杆菌密 码子优化后，Fd通过EcoRI-HindIII酶切位点构建到含有TRX的pSJ5载体上， FdR通过EcoRI-HindIII酶切位点构建到含有MBP-Tag的pSJ8载体上，重组质 粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转化子于含有相应抗性的LB培养 基中培养，0.1mM IPTG诱导表达，Ni-IDA纯化得到相应的纯酶，测序得到Fd 的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，FdR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

体外催化所用纯酶的SDS-PAGE胶图如图2所示。第1泳道是蛋白Marker， 第2泳道为NascB-P450蛋白，大小为44Kda；第3泳道为葡萄糖脱氢酶(GDH), 30.6kDa；第4泳道为FdR,大小为80.3kDa；第5泳道为Fd,蛋白大小为31.3 kDa，该胶图证明所有体外催化用的蛋白大小均正确，适用于体外催化系统。 例2-4、用于全菌催化的工程菌的获得

首先，nascB-P450-pET28a和pET21a分别用NdeI-XhoI两个限制性内切酶做 酶切，体系如下：质粒25μL,NdeI 2μL,XhoI 2μL,cutsmart buffer 5μL,dd H₂O>2O>

【实施例3】nascB-P450酶体外和体内催化反应

例3-1、nascB-P450酶体外催化反应

反应体系为500μL，催化用缓冲液为100mM pH 7.0的Heppes缓冲液，其 中含有20mM D-葡萄糖，0.2mg/mL葡萄糖脱氢酶，5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸(NADP+)，环二肽底物2mM以及5％(v/v)助溶剂DMSO,最后加入【实 施例2】例2-3纯化的P450酶终浓度为0.5mg/mL，置于4℃，静止反应24小时， 反应结束后加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，HPLC分析，分 析结果如图3-图6所示，液相分析显示共催化产生了30个产物，且所有产物均 已在液相图上标识。

例3-2、nascB-P450全菌催化反应制备化合物

根据体外催化实验结果，将例2-4中所述的全菌催化用的工程菌株转接至 500mL的LB培养基(含有0.5mL Amp、0.5mL Am、0.5mL Km)中，37℃ 220rpm培养，当OD 600值达到0.8～1.0时，将锥形瓶从摇床中取出，降温 至18℃，加入0.5mL ALA，0.5ml Fe²⁺(0.2mMFeSO₄)，100μL>

NAS-1-30共有四种不同构型的产物，代表物分别是NAS-10、11、12、27， 以下表1-4是这4种化合物的核磁共振数据：

表1.化合物NAS-10的NMR数据

表2.化合物NAS-11的NMR数据

表3.化合物NAS-12的NMR数据

表4.化合物NAS-27的NMR数据

NAS-10的质谱及核磁谱图如图7a-7f所示。

NAS-11的质谱及核磁谱图如图8a-8f所示。

NAS-12的质谱及核磁谱图如图9a-9f所示。

NAS-27的质谱及核磁谱图如图10a-10f所示。

【实施例4】抗神经损伤活性实验：

以谷氨酸盐诱导的PC-12细胞损伤凋亡实验为例，所需材料：培养基， FBS血清，马血清，谷氨酰胺，青霉素/链霉素，96孔板，PBS，CCK-8，尼莫 地平，谷氨酸(L-Glu)等。

样品配置：样品母液浓度为10mM，稀释100倍，即100μM应用液(加药 体积20μL，总体系200μL，即样品终浓度为母液稀释1000倍，为10μM)。

方法:1.取对数生长期细胞10000个/孔，160μL/孔，接种于96孔板；2.培 养24h后，分别加入待测样品20μL，每个浓度设置4个复孔；同时设置空白组， 模型组，阳性药(尼莫地平20μM)组；加药预处理1h后，加入L-Glu(15mM)， 每孔20μL；3.作用24h后，吸弃上清，补加含10％CCK-8新培养基，37℃孵 育2h后震荡溶解10min，450nm测定各孔吸光值。计算方法：抑制率％＝(OD 空白组-OD实验组)/OD空白组*100％，实验结果如下表5和表6，实验结果表明NAS-1-NAS-28对抗老年痴呆作用效果不明显，而对谷氨酸诱导的细胞凋亡 有很好的保护作用，尤其是化合物NAS-12,27,10and 11，展现出了比阳性对照 药尼莫地平更好的效果，这四个化合物有一些相同之处，首先上面的环二肽均为 cW-P，并且成键方式为C3-C6’，说明cW-P及C3-C6’类型的成键方式对提高活 性方面很关键。

表5.化合物NAS-1-28抗Aβ25-35(A4559)-诱发的PC-12细胞损伤 凋亡实验结果

表6.化合物NAS-1-28抗谷氨酸盐诱导的PC-12细胞损伤凋亡实验结果

。

序列表

<110>武汉大学

<120>一种C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱及其合成方法

<160>10

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1212

<212>DNA

<213>斐济海底的链霉菌(Streptomyces sp. CMB-MQ030)

<400>1

atgaccacca ccgcaaccct gacctatccg tttcacgatt ggagtcagga gctgagcccg60

cgctatgcac agctgcgtgc aagcgatgca cctgtgtgcc cggtggtgag tgaaggtacc 120

ggcgatccgc tgtggctggt tacccgctat gccaccgccg ttaaactgct ggaagacagc 180

cgcttcagca gtgaagccgc acaagcaagc ggtgccccgc gtcaggaacc tgttgaactg 240

cgcgcaccgg gtacacgtgg tgacgcaatc gcaatgttac gtgaagccgg cctgcgtagc 300

gtgttagccg atggtctggg tccgcgtgca gttcgtcgcc accagaagtg gattcatgag 360

tacgccgaaa ccctgattgg tgaactggtg gatcgtgaag gcacctttga tctggcacgc 420

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agcgatgaac gcgcacgtct ggtgggctgg gcagacacag gcctgcgctt ttgcggcgca 540

acccatgaag aacaggttcg cgccttcacc gaaatgcacc gcttttttct ggagcatgca 600

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cgcgacccgg atgcctttga agatccggat cgttttcgcc cgggccgcga aggtccgatg1020

cattttggct ttggccgcgg ccgtcatacc tgtccgggta atcgcctggc ccgctgtctg1080

attgaagcca ccgttcgtgc cgtggcctgt catccgggct tacgcctggc agtggcaccg1140

gaagaaattc gctggcacga gggtctgttt ttccgtcgcc cgcgcgcact gcctgccacc1200

tggtaactcg ag1212

<210>2

<211>291

<212>DNA

<213>菠菜(Spinacia oleracea)

<400>2

gctgcctaca aggtaacctt ggtaacaccc accggtaacg tagagtttca atgcccagac60

gatgtttaca tcttggatgc tgctgaagaa gaaggcattg acttgcctta ctcatgcaga 120

gctgggtcgt gctcttcatg cgccggaaag cttaagacag gtagtcttaa ccaagatgat 180

cagagttttt tggatgacga tcagatcgat gaaggatggg ttcttacctg tgctgcttac 240

cctgttagtg atgttactat tgagacccac aaggaagagg agcttactgc c291

<210>3

<211>942

<212>DNA

<213>菠菜(Spinacia oleracea)

<400>3

cagatcgcct ctgatgtgga ggcacctcca cctgctcctg ctaaggtaga gaaacattca60

aagaaaatgg aggaaggcat tacagttaac aagtttaagc ctaagacccc ttacgttgga 120

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gaaaaggctc cagacaactt caggctggat tttgcagtga gcagagagca aactaacgag 720

aaaggggaga agatgtacat tcaaacccga atggcacaat acgcagttga gctatgggaa 780

atgttgaaga aagataatac ttatgtctac atgtgtggtc tcaagggaat ggaaaaggga 840

attgacgaca ttatggtttc attggctgct gcagaaggca ttgattggat tgaatacaag 900

aggcagttga agaaggcaga acaatggaac gttgaagtct ac942

<210>4

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gtggcccgct ccggatttac taactggaag60

aggc 64

<210>5

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

gcactccacc gctgatgaca tgtatatctc cttttacgcg aacgcgaagt ccgac 55

<210>6

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

gtcggacttc gcgttcgcgt aaaaggagat atacatgtca tcagcggtgg agtgc 55

<210>7

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

gccatcaaaa ataattcgcg tctggccttc ctgtagccat cagccaatcg actggcgagc60

ggc63

<210>8

<211>401

<212>PRT

<213>斐济海底的链霉菌(Streptomyces sp. CMB-MQ030)

<400>8

Met Thr Thr Thr Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Phe His Asp Trp Ser Gln

1 5 1015

Glu Leu Ser Pro Arg Tyr Ala Gln Leu Arg Ala Ser Asp Ala Pro Val

202530

Cys Pro Val Val Ser Glu Gly Thr Gly Asp Pro Leu Trp Leu Val Thr

354045

Arg Tyr Ala Thr Ala Val Lys Leu Leu Glu Asp Ser Arg Phe Ser Ser

505560

Glu Ala Ala Gln Ala Ser Gly Ala Pro Arg Gln Glu Pro Val Glu Leu

65707580

Arg Ala Pro Gly Thr Arg Gly Asp Ala Ile Ala Met Leu Arg Glu Ala

859095

Gly Leu Arg Ser Val Leu Ala Asp Gly Leu Gly Pro Arg Ala Val Arg

100 105 110

Arg His Gln Lys Trp Ile His Glu Tyr Ala Glu Thr Leu Ile Gly Glu

115 120 125

Leu Val Asp Arg Glu Gly Thr Phe Asp Leu Ala Arg Glu Phe Ala Glu

130 135 140

Pro Leu Ser Ser Ala Val Val Ser Arg Thr Leu Leu Gly Glu Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asp Glu Arg Ala Arg Leu Val Gly Trp Ala Asp Thr Gly Leu Arg

165 170 175

Phe Cys Gly Ala Thr His Glu Glu Gln Val Arg Ala Phe Thr Glu Met

180 185 190

His Arg Phe Phe Leu Glu His Ala Arg Arg Leu Ala Ala Gly Pro Gly

195 200 205

Glu His Leu Leu Lys His Ile Ala Glu Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro

210 215 220

Leu Ser Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ala Glu Leu Leu Val Val Ala

225 230 235 240

Gly Phe Pro Thr Ser Ser Gly Phe Leu Cys Gly Ala Leu Ile Thr Leu

245 250 255

Leu Arg His Pro Glu Ser Val Gln Glu Leu His Thr His Pro Asp Arg

260 265 270

Val Pro Ser Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg His Thr Pro Leu Ala Thr

275 280 285

Gly Ala Ala Lys Arg Met Ala Thr Glu Asp Leu Glu Leu Asp Gly Val

290 295 300

Arg Ile Gly Ala Gly Glu Val Val Met Val Ser Phe Glu Ala Val Asn

305 310 315 320

Arg Asp Pro Asp Ala Phe Glu Asp Pro Asp Arg Phe Arg Pro Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Pro Met His Phe Gly Phe Gly Arg Gly Arg His Thr Cys Pro

340 345 350

Gly Asn Arg Leu Ala Arg Cys Leu Ile Glu Ala Thr Val Arg Ala Val

355 360 365

Ala Cys His Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Ala Pro Glu Glu Ile Arg

370 375 380

Trp His Glu Gly Leu Phe Phe Arg Arg Pro Arg Ala Leu Pro Ala Thr

385 390 395 400

Trp

<210>9

<211>97

<212>PRT

<213>菠菜(Spinacia oleracea)

<400>9

Ala Ala Tyr Lys Val Thr Leu Val Thr Pro Thr Gly Asn Val Glu Phe

1 5 1015

Gln Cys Pro Asp Asp Val Tyr Ile Leu Asp Ala Ala Glu Glu Glu Gly

202530

Ile Asp Leu Pro Tyr Ser Cys Arg Ala Gly Ser Cys Ser Ser Cys Ala

354045

Gly Lys Leu Lys Thr Gly Ser Leu Asn Gln Asp Asp Gln Ser Phe Leu

505560

Asp Asp Asp Gln Ile Asp Glu Gly Trp Val Leu Thr Cys Ala Ala Tyr

65707580

Pro Val Ser Asp Val Thr Ile Glu Thr His Lys Glu Glu Glu Leu Thr

859095

Ala

<210>10

<211>314

<212>PRT

<213>菠菜(Spinacia oleracea)

<400>10

Gln Ile Ala Ser Asp Val Glu Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Lys Val

1 5 1015

Glu Lys His Ser Lys Lys Met Glu Glu Gly Ile Thr Val Asn Lys Phe

202530

Lys Pro Lys Thr Pro Tyr Val Gly Arg Cys Leu Leu Asn Thr Lys Ile

354045

Thr Gly Asp Asp Ala Pro Gly Glu Thr Trp His Met Val Phe Ser His

505560

Glu Gly Glu Ile Pro Tyr Arg Glu Gly Gln Ser Val Gly Val Ile Pro

65707580

Asp Gly Glu Asp Lys Asn Gly Lys Pro His Lys Leu Arg Leu Tyr Ser

859095

Ile Ala Ser Ser Ala Leu Gly Asp Phe Gly Asp Ala Lys Ser Val Ser

100 105 110

Leu Cys Val Lys Arg Leu Ile Tyr Thr Asn Asp Ala Gly Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Gly Val Cys Ser Asn Phe Leu Cys Asp Leu Lys Pro Gly Ala Glu

130 135 140

Val Lys Leu Thr Gly Pro Val Gly Lys Glu Met Leu Met Pro Lys Asp

145 150 155 160

Pro Asn Ala Thr Ile Ile Met Leu Gly Thr Gly Thr Gly Ile Ala Pro

165 170 175

Phe Arg Ser Phe Leu Trp Lys Met Phe Phe Glu Lys His Asp Asp Tyr

180 185 190

Lys Phe Asn Gly Leu Ala Trp Leu Phe Leu Gly Val Pro Thr Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Leu Tyr Lys Glu Glu Phe Glu Lys Met Lys Glu Lys Ala Pro

210 215 220

Asp Asn Phe Arg Leu Asp Phe Ala Val Ser Arg Glu Gln Thr Asn Glu

225 230 235 240

Lys Gly Glu Lys Met Tyr Ile Gln Thr Arg Met Ala Gln Tyr Ala Val

245 250 255

Glu Leu Trp Glu Met Leu Lys Lys Asp Asn Thr Tyr Phe Tyr Met Cys

260 265 270

Gly Leu Lys Gly Met Glu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Met Val Ser Leu

275 280 285

Ala Ala Ala Glu Gly Ile Asp Trp Ile Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Lys

290 295 300

Lys Ala Glu Gln Trp Asn Val Glu Val Tyr

305 310