模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽及其检测试剂盒，所述环状多肽氨基酸序列为CVPSKPGLC，如SEQ ID No.1所示。所述试剂盒包含AFB1竞争抗原、包埋有抗AFB1单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素B1的标准溶液和辣根过氧化物酶标记链霉亲和素等；本发明的多肽序列可以模拟AFB1的抗原表位，可以和筛选所用抗体特异性结合，灵敏度高、特异性强，减少了AFB1对操作人员的暴露，是一种更安全、更高效的检测方法。该发明对解决AFB1在农产品中的污染监测具有重要的现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析化学技术领域，具体涉及一种模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽及其检测试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFTs)主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类具有强毒性的次级代谢产物。AFTs主要可分为B族、G族和M族。B族AFTs是能在365nm紫外光激发下发出蓝色荧光，又可分为Aflatoxin B1(AFB1)和AFB2。其中AFB1是毒性最大，被世界卫生组织癌症研究机构定义为I类致癌物，即对人类有确认致癌性的物质。湿热的环境、不当的收获和储藏方式都会导致AFB1的产生，其主要污染大米、花生、玉米、粮油制品等。

检测黄曲霉毒素B1常规的免疫分析方法所采取的多是竞争性分析。先制备竞争性抗原：通过琥珀酰亚胺酯法在AFB1分子上引入羧基，生成黄曲霉毒素B1肟，再用活性酯法与载体蛋白(牛血清白蛋白或卵清蛋白)偶联，该偶联物所暴露的抗原表位可以与AFB1竞争抗AFB1抗体，常常包被在酶标板上作为包被抗原使用。但是该包被抗原在制备和应用的过程中，会使操作人员暴露在AFB1环境中，而且制备黄曲霉毒素B1肟时需要高温高压等专业设备，具有一定的潜在危害性，而且该竞争性抗原制备成本高、批次影响较大。

因此，迫切需要制备并开发出更安全更高效的快速免疫试剂盒和分析方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种模拟黄曲霉毒素B1(AFB1)抗原表位的环状多肽及其检测试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作方法简单、更安全高效的特点；其可以用于农产品中AFB1的快速筛查和监测。

为实现上述目的，本发明所设计一种模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽，其特征在于：其氨基酸序列为CVPSKPGLC，如SEQ ID No.1所示。

上述模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽制备得到方法之一：

1)将抗AFB1单克隆抗体经纯化后包被于酶标板上，加入商业化的噬菌体展示环七肽库Ph.D.-C7C(该肽库购自New England Biolabs公司，该肽库中多肽展示在丝状噬菌体M13的PIII蛋白上)，然后用AFB1竞争性洗脱后得到特异性模拟AFB1抗原表位的噬菌体展示多肽，将该多肽测定DNA序列后，翻译成氨基酸序列，化学合成该多肽序列，如SEQ ID No.1所示。

2)按SEQ ID No.1所示的序列人工合成即可得到氨基酸序列为CVPSKPGLC。

本发明公开了一种包含上述多肽的检测黄曲霉毒素B1试剂盒，所述试剂盒包含如下部分：

(1)AFB1竞争抗原，且所述AFB1竞争抗原为生物素标记的权利要求1所述环状多肽；

(2)包埋有抗AFB1单克隆抗体的酶标板

(3)黄曲霉毒素B1的标准溶液；

(4)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，即为酶标二抗；

(5)洗涤缓冲液；

(6)样品稀释液；

(7)显色A液；

(8)显色B液；

(9)2M的硫酸液。

进一步地，所述AFB1竞争抗原是由检测黄曲霉毒素AFB1的环状多肽与生物素偶联而成。再进一步地，所述洗涤缓冲液PBST的配方为：氯化钠40g、磷酸二氢钾8g、磷酸氢二钠29g、氯化钾8g、Tween-20 2.5ml、蒸馏水20mL。

所述黄曲霉毒素B1的标准溶液浓度包括30、10、2、1、0.2、0.02ng/mL；

所述样品稀释液：含体积分数为10％甲醇的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的配方为氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g。

所述显色A液：过氧化脲1g，柠檬酸10.3g，Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，Tween-20>

所述显色B液：四甲基联苯胺(TMB)300mg(50mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4-2.6。

本发明还公开了一种利用上述试剂盒检测黄曲霉毒素B1的竞争性免疫分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将AFB1竞争抗原与待测样品等体积混合后，加入包埋有抗AFB1单克隆抗体的酶标板中；

2)用洗涤缓冲液洗涤酶标板后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(酶标二抗)，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板，加入显色A液和显色B液的混合液进行显色，然后加入2M的硫酸液终止；

3)用酶标仪于450nm波长测定待测孔的OD值，利用黄曲霉毒素B1的标准溶液建立标准曲线，根据已建立的标准曲线与待测孔的OD值对应换算，即得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。

本发明还提供了上述检测黄曲霉毒素B1试剂盒在检查大米中AFB1含量中的应用。

本发明的原理：

基于生物素标记的环状多肽检测AFB1的竞争性免疫分析方法原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗AFB1抗体，加入等体积生物素标记的环状多肽与待测AFB1标准品或样品的混合物，生物素标记的环状多肽和待测AFB1相互竞争与抗体反应，由于每个孔中的包被抗体和加入的生物素标记的环状多肽含量均一致，所以当待测的AFB1浓度高时，则被结合在固相包被抗体上的生物素标记的环状多肽就少，加入的酶标二抗与被固定生物素标记的环状多肽结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测AFB1浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的AFB1标准品浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测样品中AFB1的浓度。

本发明中多肽作为与AFB1竞争的元件，不仅可以模拟AFB1与抗体结合的抗原表位，还可以借助生物素和链霉亲和素的高亲和力将该检测信号放大，建立安全无毒AFB1的竞争性免疫分析方法。因此，生物素标记的环状多肽是一种非常安全高效的AFB1竞争性抗原。

本发明中筛选得到特异性模拟AFB1抗原表位的环状多肽(多肽一共9个氨基酸，两侧的半胱氨酸氧化后形成环状，如图1，能够模拟AFB1的抗原决定簇，成为替代AFB1竞争性抗原的试剂)，序列为CVPSKPGLC，该序列能有效模拟AFB1与抗体的结合表位，可以与抗AFB1单克隆抗体结合，通过在大米样品中添加定量的AFB1，经简单前处理后用所建立的免疫分析方法测定，并对该方法进行验证。

本发明的有益效果：

1.检测农产品中AFB1的通用免疫分析方法为间接性免疫分析方法，一般需要将AFB1处理后与载体蛋白连接作为竞争性抗原，这个过程操作人员会暴露在AFB1的环境中，具有潜在的危害性。

本发明筛选得到了特异性模拟AFB1抗原表位、序列为CVPSKPGLC的多肽，该多肽可以与抗AFB1单克隆抗体结合，通过生物素标记该多肽，成功替代了传统的竞争性抗原，所建立的方法是一种安全无毒的检测AFB1的免疫分析方法。

2.生物素标记的环状多肽作为竞争性抗原，采用链霉亲和素和辣根过氧化物酶的偶联物作为酶标二抗，可以显著提高检测方法的灵敏度，采用本发明中生物素标记的环状多肽作为竞争性抗原所建立方法的IC₅₀为0.92ng/mL，能准确测定大米样品中AFB1的含量。

3.本发明中所要保护的试剂盒中包括了生物素标记的环状多肽、抗AFB1单克隆抗体、酶标二抗等试剂，能够满足农产品样品的检测要求，是一种安全、简单、便携的AFB1的检测方法。

综上所述：本发明涉及特异性竞争AFB1的噬菌体多肽的筛选、多肽的氨基酸序列、多肽与生物素的偶联、免疫分析方法的建立，

本发明首次用生物素标记的噬菌体来源的环状多肽并作为竞争性抗原检测农产品中的AFB1的含量。这种方法代替传统AFB1包被抗原的制备和使用，极大的减少了AFB1对操作人员的暴露，因此，该方法是一种高效安全灵敏的测定方法。

附图说明

图1为来源于噬菌体展示系统的环状多肽示意图；

图2为用Phage ELISA方法鉴定阳性噬菌斑示意图，

图3为试剂盒中黄曲霉毒素B1的标准溶液建立的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

下述实验样品均购于市场，且部分商品说明购买来源：

实施例1噬菌体展示多肽的特异性淘选与扩增

噬菌体展示特异性多肽的淘选

在96孔酶标板上包被5个孔，第1个孔为100μg/mL抗体，其余4个包被3％BSA，4℃包被过夜，次日加入200μL 0.05％PBST洗板3次；1％BSA封闭酶标板，25℃孵育2h，洗板3次；孔1中加入1μL噬菌体展示环七肽库，孵育1h，洗板后加入500ppb AFB1竞争性洗脱，25℃孵育1h，将洗脱液转移至孔2、3、4、5孔中，25μL/孔，孵育1h后，收集上清液，则为淘选后的洗脱液，利用上层平板法测定洗脱液中噬菌体的滴度。第二轮淘选与第三轮淘选抗体浓度依次减半(50μg/mL、25μg/mL)，使用的PBST洗涤液中吐温-20的浓度分别为0.1％和0.15％。

洗脱噬菌体的扩增

将大肠杆菌E.coli ER2738菌液接入20mL LB液体培养基中，待OD_600nm为0.6～1.0时，加入上述洗脱的噬菌体，37℃震荡培养4.5h后，将菌液转移至50mL离心管中，4℃8000rpm离心10min。向上清液加入1/6体积的20％PEG/NaCl沉淀噬菌体，4℃静置过夜；次日，4℃10000rpm离心15min，用1mL>

实施例2特异性多肽的鉴定与测序

从上述第三轮测定洗脱噬菌体的平板上挑取单克隆，采用Phage ELISA的方法测定噬菌体展示多肽克隆模拟AFB1抗原表位、结合抗体的能力，具体操作为：将挑取的噬菌斑接种在2mL LB培养基中(含1:100对数前期E.coli ER2738)，37℃震荡培养6h后，10000rpm离心10min，收集上清液。每个克隆用3个孔测定，孔1和孔2包被筛选所用抗体100μL(10μg/mL)，孔3包被1％BSA做空白对照，用PBST洗涤后，加入3％脱脂牛奶封闭2h(300μL/孔)，孔1加入50μL500ppb AFB1和50μL噬菌斑培养上清的混合液，孔2和孔3均加入50μL 10％甲醇PBS和50μL噬菌斑培养上清液的混合液，37℃孵育30min，PBST洗板3次。各孔加入100μL抗M13噬菌体抗体-HRP，37℃孵育30min后，洗板3次，每孔加入100μL底物显色液，常温避光显色5-15min后，加入50μL 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测定450nm下各孔吸光值，孔2吸光度值高于孔1和孔3的克隆为阳性噬菌斑。将阳性噬菌体扩增后提取DNA后测序，采用通用引物-96gⅢ(5-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3)。

经Phage ELISA测定噬菌斑的竞争结合能力，如图2所示，其中克隆3-C-43竞争性抑制效果最好，因此将该克隆扩增后测序，该克隆DNA序列为GTGCCTAGTAAGCCGGGGCTG，翻译得到氨基酸序列为CVPSKPGLC，即为检测黄曲霉毒素AFB1的环状多肽。

实施例3生物素标记的环状多肽的合成

生物素与环状多肽中的-NH2进行反应，该环状多肽序列中共有两个游离的-NH2，一个在N端，另一个在赖氨酸的R基上，因此将环状多肽与生物素以1:2的比例连接。称取2mg的环状多肽，加入50μL DMF和2mL PBS缓冲液溶解多肽；

称取4.6mg生物素，加入50μLDMF进行溶解，取22μL溶解后的生物素逐滴加到溶解后的多肽中，冰浴2h后透析24h，即得到生物素标记的环状多肽。

实施例4基于生物素标记的环状多肽免疫分析方法检测AFB1的试剂盒，试剂盒包含如下部分：

(1)上述生物素标记的环状多肽；

(2)包被有抗AFB1单克隆抗体的96孔酶标板；

(3)黄曲霉毒素B1的标准溶液；

(4)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(酶标二抗)；

(5)浓缩洗涤缓冲液(PBST)的配方为：氯化钠40g、磷酸二氢钾8g、磷酸氢二钠14.5g、氯化钾8g、Tween-20 2.5ml、蒸馏水20ml；

(6)样品稀释液：含10％甲醇的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的配方为氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g；

(7)显色A液：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，Tween-20>

(8)2M的硫酸液。

本试剂盒组装完成后，抗体包被板与生物素标记的环状多肽在-20℃下至少可保存1年，其他试剂常温保存。

实施例5基于生物素标记的环状多肽的免疫分析方法测定AFB1

使用上述抗AFB1单克隆抗体作为包被抗体，先将生物素标记的环状多肽和AFB1样品等体积混合后加入包被有抗AFB1单克隆抗体的酶标孔中，共同竞争该抗体，再加入酶标二抗和底物，通过底物显色的程度判断样品中AFB1的含量。用竞争免疫分析方法测定AFB1，其步骤如下：

(1)平衡：将已处理好抗AFB1单克隆抗体的酶标板从包装中取出，放于室温平衡15min；

(2)洗板：每孔加入200μL的PBST(含0.05％(v/v)Tween20的PBS(pH 7.4)，放置1min，再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留PBST在吸水纸上拍干；

(3)竞争反应：现将生物素标记的环状多肽与等体积的AFB1标准器或待测样品提取液混合，标准溶液和样品稀释液均用含10％甲醇的PBST；再加入100μL到封闭好的酶标孔中，在室温下反应1h，洗板；

(4)加酶标二抗：将酶标二抗(链霉亲和素与辣根过氧化物酶的偶联物)用PBST按1:1,000稀释，每孔加入100μL，在室温下反应1h，洗板；

(5)显色：A液配制：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，Tween-20100μL，蒸馏水1000mL，pH5；B液配制：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40ml>

(6)终止及测定：每孔加入50μL浓度为2M的硫酸液终止反应，立即用酶标仪于450nm波长测定各孔的OD值。

用筛选所用的抗AFB1单克隆抗体作为包被抗原，基于生物素标记的环状多肽建立的免疫分析方法检测AFB1的标准抑制曲线。AFB1的系列标准浓度设置范围为0～30ng/mL。以四参数方程拟合标准曲线(见图3)，灵敏度用抑制最高OD值一半时所需的AFB1的浓度表示，即抑制中浓度IC₅₀值，该标准曲线的IC₅₀值为0.92ng/mL。曲线的线性范围IC₂₀-IC₈₀值为0.23-3.36ng/mL。

实施例6特异性实验

选择黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和桔霉素作为待测物，测得各物质的IC₅₀值，再用下列方程式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则多肽对AFB1的特异性愈强，反之则特异性差。

交叉反应(CR％)＝IC₅₀(AFB1)/IC₅₀(供试物)×100％

实验测定结果见表1，采用实施案例3的方法，该生物素标记的环状多肽不能够识别待测物(交叉反应率<1％)，只能识别AFB1，因此该方法特异性强，可以确保对样品中AFB1含量测定结果的可靠性。

表1基于多肽的免疫分析方法与不同真菌毒素的交叉反应

实施例7样品检测

从超市中购买大米样品，经HPLC-FLD鉴定样品中不含AFB1。称取5.0g大米在50mL烧杯中，往样品中添加1.5mLAFB1标准品(用甲醇溶解)，使大米样品中AFB1的终浓度为10ng/g,20ng/g和40ng/g。样品前处理：向5g大米样品中加入15mL甲醇，混匀，超声萃取5min，5000rpm离心10min，上清液用PBS稀释10倍后用实施例4所述方法检测AFB1的含量。添加回收的检测结果见表2，批内分析的平均回收率是84.1～96.7％，变异系数2.1～6.3％；批间分析的平均回收率是80.5～89.1％，变异系数5.4～9.2％。该方法的准确度和精确度均符合实际检测要求，可用于AFB1在大米样品中的快速筛查。

表2大米样品中AFB1的添加回收测定结果

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 模拟黄曲霉毒素B1抗原表位的环状多肽及其检测试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

Cys Val Pro Ser Lys Pro Gly Leu Cys

1 5