一种快速测定烟草中甲霜灵残留含量的方法

摘要

本发明公开了一种快速测定烟草中甲霜灵残留含量的方法。运用电化学分析法，以甲霜灵作为模板分子，邻苯三酚为修饰材料，利用电聚合手段将甲霜灵分子印迹膜修饰到玻碳电极表面，制得电化学传感器。邻苯三酚的引入不仅可以增加电子传递速率，且与分子印迹膜结合后，使印迹材料的比表面积增加，电流响应信号增强，提高了传感器的灵敏度，选择性好。该方法回收率范围为98.5％～107.8％；变异系数小于4.01％；检出限和定量限分别为0.003mg Kg

说明书

技术领域

本发明属于农作物农药残留检测技术领域，具体是涉及一种利用电化学工作站对烟草中的甲霜灵残留含量进行快速检测的方法。

背景技术

对烟草农残的控制是保证烟草制品吸食安全的重要手段，近年来一直是烟草行业乃至社会关注的焦点，也是国际国内贸易检验的重点。对农残的控制尤其是对农残的有效检测技术研究，不仅对保障消费者健康和生态环境安全有重要意义，同时也是保证烟叶质量和烟草企业生产效益的重要内容。农药甲霜灵是一种广谱、高效、低毒的内吸杀菌剂，在烟草中施用非常广泛，尽管属于低毒类农药，但由于使用量不断提高、使用范围不断扩大，其环境生态、农药残留等问题引起了广泛的关注，世界各国对植物中甲霜灵的残留量都有明确的规定，因此对甲霜灵实现快速、准确和高灵敏度定量分析的需求日益突出。

现行的烟草行业甲霜灵检测标准为高效液相色谱-串联质谱法，该方法不仅使用的设备昂贵、检测成本高、检测周期长，而且需要专业人士操作，因此难以普及，无法满足企业发展和烟叶安全质量管控的需要。如何实现对烟草中甲霜灵农残的快速、简便、低成本检测就成为现有技术中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、简便、灵敏、可靠地测定烟草中甲霜灵农药残留含量的电化学分析方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种快速测定烟草中甲霜灵残留含量的方法，具体采用以下步骤：

(1)电化学传感器的制备

①玻碳电极预处理

将玻碳电极依次用0.5μm和50nm的Al₂O₃粉在麂皮上抛光，将抛光后的玻碳电极依次用50％HNO₃水溶液、无水乙醇和去离子水超声清洗5min，再用去离子水冲洗后自然晾干；

②聚邻苯三酚修饰电极的制备

称取1.51mg邻苯三酚置于10mL 0.1mol/L的NaOH溶液中，混匀得到浓度为1.2mmol/L的邻苯三酚溶液；将预处理好的玻碳电极置于邻苯三酚溶液中，浸泡10min，用CV法在-0.4～1.0V电位范围内以20mV/S速率聚合10圈，使邻苯三酚聚合膜沉积在玻碳电极表面，再用去离子水冲洗玻碳电极表面，置于0.1mol/L NaOH中，以100mV/s速率在-0.4～1.0V电位范围内扫3圈CV以去除电极表面未聚合的邻苯三酚，得到聚邻苯三酚修饰玻碳电极；

③甲霜灵印迹传感器的制备

将0.16mmol苯酚与0.01mmol甲霜灵溶于10mL pH＝9的硼砂-硼酸缓冲液中，通N₂20min除氧制得预聚合液；将聚邻苯三酚修饰玻碳电极浸于预聚合液中以50mV/s速率在0.2～0.8V电位范围内扫40圈CV，在聚邻苯三酚修饰玻碳电极表面沉积甲霜灵分子印迹膜，得到印迹电极；接着将印迹电极浸于甲醇/乙酸v/v＝3:1的洗脱液中，用磁力搅拌洗脱20min以去除模板分子甲霜灵，得到甲霜灵印迹传感器；

(2)待测样品溶液处理

称取1.0g待测烟草样品置于25mL聚乙烯离心管中，加入10mL乙腈作为萃取液，超声10min，过滤后加入3g NaCl，静置待分层后，取上层乙腈层1.5mL加入试剂包净化，过滤得到待测样品溶液；所述的试剂包为150mg无水硫酸镁和25mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂的混合物；

(3)铁氰化钾缓冲液配制

称取0.1646g K₃Fe(CN)₆和0.7455g>

(4)绘制标准工作曲线

用乙腈作为溶剂，配制甲霜灵储备液，移取甲霜灵储备液至10mL铁氰化钾缓冲液中，获得浓度为3×10^-9～1.8×10^-5mol/L范围内的系列标准工作液，绘制标准曲线；响应电流△i与甲霜灵的浓度c在3×10^-9～1.8×10^-5mol/L范围内，线性回归方程分别为△i＝1.1416+0.4070c，相关系数r²＝0.9968，c的单位为μmol>-1；

(5)用电化学工作站进行分析

用CHI660型电化学工作站进行检测，采用三电极系统：步骤(1)所得的甲霜灵印迹传感器为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极SCE为参比电极；将三电极系统放入10mL铁氰化钾缓冲液中，平衡，待背景电流稳定后，进行循环伏安CV和差示脉冲DPV的测定；

CV测定条件：扫描范围为-0.2～0.6V，扫描速率为100mV/s；

DPV测定条件：扫描范围为-0.2～0.6V，扫描速率为100mV/s，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.016s；

(6)结果计算

以干基计的甲霜灵残留量R，以毫克每千克表示，按下式计算：

式中：

R—以干基计的甲霜灵残留量(mg>-1)；

C—标准工作曲线计算得到的结果(μmol>-1)；

V—萃取液体积(mL)；

M—甲霜灵的摩尔质量(g mol^-1)；

m—待测样品质量(g)。

步骤(5)所述的平衡，优选时间为2min。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明首创实现对烟草中的甲霜灵农药残留含量进行快速、准确测定。运用电化学分析法，以甲霜灵作为模板分子，邻苯三酚为修饰材料，利用电聚合手段将甲霜灵印迹聚合膜修饰到玻碳电极表面，制得甲霜灵电化学传感器。结果表明，邻苯三酚的引入不仅可以增加电子传递速率，且与分子印迹膜结合后，使印迹材料的比表面积增加，电流响应信号增强，提高了传感器的灵敏度，选择性好，能够满足烟叶样品中甲霜灵残留含量的快速、准确检测。

2、该方法的回收率范围为98.5％～107.8％；4个样品平行检测5次，变异系数均小于4.01％；检出限和定量限分别为0.003mg>-1、0.01mg>-1，均优于现有技术。

3、本发明方法较现有技术前处理简单、操作简便、检测速度快，准确度和精密度高，成本低廉，具有良好的应用前景。

附图说明

图1印迹传感器的循环伏安表征图；

图2模板/单体的摩尔比对传感器响应电流的影响；

图3电聚合扫描圈数对传感器响应电流的影响；

图4硼砂缓冲液pH对传感器响应电流的影响；

图5标准工作曲线；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。

实施例1

1实验原理、材料及方法

1.1实验原理

利用邻苯三酚信号放大策略，结合分子印迹技术制备的电化学传感器，能特异识别无电活性的甲霜灵分子，借助有电活性的铁氰化钾探针[Fe(CN)₆]^3-，铁氰化钾缓冲液中的甲霜灵分子在印迹膜中自由进出会引起三电极系统的峰电流电信号有规律的变化，通过电化学工作站监测峰电流的变化，对照标准工作曲线，计算得到甲霜灵的含量。

1.2主要仪器与试剂

CHI660型电化学工作站(上海辰华公司)，采用三电极系统:裸/修饰邻苯三酚的玻碳电极、分子印迹膜修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极；高效液相色谱-质谱质谱联用仪(安捷伦科技有限公司)。

甲霜灵(Met)、烯酰吗啉(Dim)、苯霜灵(Ben)和氟吗啉(Flu)标准品购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；苯酚、邻氨基酚、邻苯二胺、邻苯三酚、间苯二胺均购于天津光复化工研究院；实验所用试剂除特殊说明，均为分析纯；水为18.25MΩcm去离子水。

1.3实验方法

1.3.1玻碳电极预处理

将玻碳电极依次用0.5μm、50nm的Al₂O₃粉在麂皮上抛光，接着依次用50％HNO₃水溶液、无水乙醇和去离子水超声清洗5min，再用去离子水冲洗后自然晾干。

1.3.2聚邻苯三酚修饰电极的制备

称取1.51mg邻苯三酚于10mL 0.1mol/L的NaOH溶液中，混匀得到浓度为1.2mmol/L的邻苯三酚溶液。将预处理好的玻碳电极置于邻苯三酚溶液中，浸泡10min，用CV法在-0.4～1.0V电位范围内以20mV/S速率聚合10圈，使邻苯三酚聚合膜沉积在玻碳电极表面。再将电极用去离子水冲洗表面后，置于0.1mol/L NaOH中，以100Mv/s速率在-0.4～1.0V电位范围内，扫3圈CV以去除电极表面未聚合的邻苯三酚，得到聚邻苯三酚修饰玻碳电极。

1.3.3甲霜灵印迹传感器的制备

将0.16mmol苯酚与0.01mmol甲霜灵溶于10mL硼砂-硼酸缓冲液(pH＝9)中，通N₂20min除氧制得预聚合液，将聚邻苯三酚修饰玻碳电极浸于预聚合液中以50mV/s速率在0.2～0.8V电位范围内扫40圈CV，即可在聚邻苯三酚修饰玻碳电极表面沉积甲霜灵分子印迹膜，得到印迹电极。聚合完成后，将印迹电极浸于甲醇/乙酸(v/v＝3:1)的洗脱液中，用磁力搅拌洗脱20min以去除模板分子甲霜灵，得到甲霜灵印迹传感器。

1.3.4电化学检测

称取0.1646g K₃Fe(CN)₆和0.7455g>

用电化学工作站进行检测，将三电极系统放入10mL铁氰化钾缓冲液中平衡，待背景电流稳定后，进行循环伏安(CV)和差示脉冲(DPV)的测定。其中，CV测定条件：扫描范围为-0.2～0.6V，扫描速率为100mV/s；DPV测定条件：扫描范围和速率同CV，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.016s。裸玻碳电极直接进行测定；甲霜灵电化学传感器在含待测液的铁氰化钾缓冲液中平衡2min后再进行测定，测定结束后，置于10mL甲醇/乙酸体积比为3:1的洗脱液中洗脱20min后取出，于4℃冰箱保存待用。

1.3.5烟草样品前处理及分析

称取1.0g烟草样品于25mL聚乙烯离心管中，加入10mL乙腈作为萃取液，超声10min，过滤后加入3g NaCl，静置待分层后，取上层乙腈层1.5mL加入试剂包(150mg无水硫酸镁和25mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂)净化，过滤待用；

用电化学工作站进行分析。

以干基计的甲霜灵残留量R，以毫克每千克(mg/Kg)表示，按式(1)计算：

式中：R—以干基计的甲霜灵残留量(mg/Kg)，C-标准工作曲线计算得到的结果(μmol/L)，V-萃取液体积(mL)，M–甲霜灵的摩尔质量(g/mol)，m—样品质量(g)。

1.3.6结果计算

以两次平行测定的平均值为最终测定结果，两次平行测定结果绝对值之差不应超过5％。

2结果与讨论

2.1传感器的分子印迹效应

由于印迹膜中印迹孔穴可作为电子传质通道，通道中发生的分子识别行为可改变电活性物质的量，从而使铁氰化钾的氧化电流信号发生变化，因此可通过铁氰化钾氧化还原的电流信号研究膜的形态特征并间接分析被测物浓度。甲霜灵在-0.2～0.6V电位范围内不出峰，故借助铁氰化钾来表征各修饰电极，结果如图1所示。曲线a为裸电极，当电极表面修饰邻苯三酚膜后，峰电流显著增大，达180μA，表明修饰的邻苯三酚具有较大的比表面积和良好的导电性能，其协同作用提高了电极的导电性能(曲线b)。当甲霜灵印迹膜沉积到邻苯三酚电极表面，由于电极表面被一层致密的不导电膜覆盖，无传质通道，氧化还原峰消失(曲线c)。当用洗脱液去除模板分子后，由于膜中印迹孔穴的形成，探针可通过孔穴到达电极表面发生反应，从而峰电流重新增加(曲线d)。在曲线e中，峰电流减小，是由于印迹膜再次吸附甲霜灵，使得传质通道被堵塞。

2.2电化学传感器制备条件的优化

2.2.1模板/单体摩尔比的影响及优化

单体种类及其与模板分子的浓度比对聚合膜性能有较大的影响，实验对聚合底液中模板与单体的浓度比进行了优化。配制模板/单体摩尔比为1:8、1:12、1:16、1:20和1:24的聚合底液制备系列传感器，结果发现(图2)，当模板/单体摩尔比为1:16的聚合底液制备的传感器，对8×10^-6mol/L甲霜灵有最大的响应电流。

2.2.2电聚合圈数的优化

电聚合过程的扫描圈数对传感器的影响如图3所示，聚合扫描20、30、40、50和60圈的传感器对模板分子响应值先增加后减少，当扫描40圈时的电极响应最大。这是由于随着聚合圈数的增加，分子印迹膜逐渐变厚，位于印迹膜内部的模板分子不能被完全洗脱，从而使得传感器的灵敏度降低。因此本实验选择电聚合扫描圈数为40圈。

2.2.3pH的影响

固定苯酚浓度为0.016mol/L，改变聚合底液硼砂缓冲液的pH值(7.1，8.0，8.4和9.0)，制备系列传感器，用DPV法探讨传感器对甲霜灵的响应情况(图4)。结果表明随着pH增大，传感器的响应值一直增加，当pH＝9时，制得的传感器对8×10^-6mol/L甲霜灵响应电流最大，说明此条件下，更多的识别位点被占据，分子印迹效果最好。因此，实验选择pH＝9的硼砂缓冲液作为聚合基底液。

2.2.4模板洗脱液及时间的确定

甲醇与乙酸的混合液是洗脱非共价型分子印迹聚合物中模板分子的常用洗脱剂，实验选取不同体积比(2/1，3/1，4/1)的甲醇/乙酸用以去除模板分子。结果发现体积比为3:1的甲醇/乙酸去除模板效果最好，2/1的甲醇/乙酸难以洗脱模板，4/1的甲醇/乙酸会导致印迹膜轻微溶胀，导致膜被破坏，因此选择3:1的甲醇/乙酸作为洗脱剂。将传感器置于3:1的甲醇/乙酸中磁力搅拌洗脱后，用水冲洗，再进行CV扫描，结果发现随着搅拌时间的增加，CV峰电流不断升高。这是由于印迹膜中的甲霜灵不断被溶出，印迹孔穴增多，到达电极表面的铁氰化钾探针增多的缘故。当洗脱时间超过20min后，峰电流不再增加，说明印迹膜中的模板被全部去除，因此洗脱时间确定为20min。

2.2.5平衡时间的选择

考察了甲霜灵在印迹膜上的平衡时间对电极响应的影响情况。将甲霜灵印迹传感器浸入含8×10^-6mol/L甲霜灵的铁氰化钾缓冲液中，每隔20s用灵敏度较高的DPV扫描，结果发现随着平衡时间的延长，DPV峰电流不断降低，响应值不断增大，当平衡时间为2min时峰电流值不再降低，响应值达到最大，说明印迹膜中甲霜灵结合位点吸附趋于饱和，所以实验确定平衡时间为2min。

2.3标准工作溶液线性相关的浓度范围

依次添加1×10^-3mol>-1甲霜灵乙腈溶液0.03μL，19.97μL，20μL，20μL，20μL，20μL，20μL，20μL，20μL，20μL至10mL铁氰化钾缓冲液中；得到浓度分别为3×10^-9，2×10^-6，4×10^-6，6×10^-6，8×10^-6，1×10^-5，1.2×10^-5，1.4×10^-5，1.6×10^-5，1.8×10^-5mol/L的标准工作液。

采用DPV进行工作曲线的绘制，结果如图5所示，甲霜灵的浓度c在3×10^-9～1.8×10^-5mol/L浓度范围内线性相关，线性回归方程分别为△i＝1.1416+0.4070c(μmol/L)(r²＝0.9968)。

而未修饰邻苯三酚的电化学传感器，Ben的浓度c在4×10^-8～3.7×10^-6mol/L浓度范围内线性相关，线性回归方程为△i＝1.4003+0.3492c(μmol/L)(r＝0.9947)，说明邻苯三酚的引入扩宽了该方法的检测范围。

2.4电化学传感器的选择性

实验测定了传感器在铁氰化钾缓冲液中对8.0×10^-6mol/L>

烟草样品基质成分尤其复杂，而甲霜灵仅是其中一种痕量农残，行业标准的前处理方法包含提取和两步净化，还需冷冻和多次涡旋，非常繁琐；该电化学传感器因具有对甲霜灵的专一性识别功能，无论基质多复杂，都能精准识别甲霜灵分子，前处理方法可大大简化，如1.3.5所述，仅需简单提取和一步净化便可上机检测，操作较为简单，适宜在基层推广。

2.5重现性和稳定性

实验进一步研究了所制备电极的重现性和稳定性，用相同方法制备的五支传感器对相同浓度的甲霜灵进行测定，相对标准偏差为4.12％；用同一支电极对8.0×10^-6mol/L的甲霜灵平行测定5次，相对标准偏差为3.26％。3周后同等条件下测定甲霜灵的响应值基本没有变化，使用60次后响应值仍能保持在初始响应的86％，表明此电极具有较长的寿命和良好的重现性和稳定性。

2.6实际样品分析和回收率

将4个烟草样品用该实验方法进行甲霜灵的检测，并进行加标回收试验，结果见表1。由表1可知，电化学分析法测定结果的相对标准偏差小于4.01％，加标回收率为98.5％～107.8％，初步说明测定结果是准确可靠的。

表1烟草样品中甲霜灵的加标回收试验结果(n＝5)

Table 1Determination of metalaxyl in real samples by MIM/Pyrogallol/GCE

为进一步验证此传感器的测定结果，采用液相串联质谱法测定4个烟草样品中的甲霜灵，测定结果见表2。由表2可知，与电化学分析法的检测结果基本一致。

表2比对试验结果(μmol/L)

Table 2the results of Comparison experiment(μmol/L)

2.7检出限和定量限

采用最低浓度标准溶液，连续检测20次，测定结果的标准偏差为0.001mg>-1，因此方法的检出限为3SD＝0.003mg>-1，定量限为10SD＝0.01mg>-1，而行业标准对甲霜灵的检出限和定量限分别为0.015mg>-1和0.050mg>-1，说明该电化学传感器的灵敏度高。

2.8检测成本

本发明中检测仪器电化学工作站的购入成本为10余万元，而行标检测仪器高效液相色谱-串联质谱的购入成本为200余万元，第三方检测机构1个甲霜灵农残样品的检测成本为1100余元，而电化学工作站的检测成本仅为100余元，电化学工作站仪器购入成本低，检测成本低，适宜在基层进行推广使用。

2.9结论

本发明采用甲霜灵作为模板分子，邻苯三酚为修饰材料，利用电聚合手段将甲霜灵分子印迹膜修饰到玻碳电极表面，制得电化学传感器。结果表明，邻苯三酚的引入不仅可以增加电子传递速率，且与分子印迹膜结合后，使印迹材料的比表面积增加，电流响应信号增强，扩大了检测范围，提高了灵敏度，缩短了检测周期，选择性好使得前处理方法大大简化。且电化学工作站购入成本低，检测成本低，操作简便，适宜在基层进行推广使用。