一种三萜类化合物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用

摘要

本发明提供了一种三萜类化合物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用，所述三萜类化合物的结构如式（Ⅰ）所示，其中，R为COCH

说明书

技术领域

本发明涉及三萜类化合物，具体涉及一种三萜类化合物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤，俗称癌症，是指机体在各种致瘤因素作用下，由于局部组织细胞异常增生引起的可以侵染、扩散的肿块。恶性肿瘤可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，是严重威胁人类健康和社会发展的疾病。伴随着我国经济的发展和人民物质文化生活水平的提高，人们的生活方式已经发生了巨大的改变，同时我国大气、环境污染等问题不断凸显，人口逐渐趋于老龄化，这些都导致了中国癌症的发病率升高。国家癌症中心数据显示，癌症已成为中国城市居民的第一杀手，在农村居民死因中也居于第二，在中国已成为新常态。

然而，在中国癌症发病率日益提高的背景下，我国具有自主知识产权的抗癌药研发速度趋于滞后。在现今医学背景下，几乎所有癌症病人的免疫功能都已受到严重损伤，然而传统西药化学疗法会进一步破坏骨髓造血功能，导致癌细胞失去免疫控制，加速生长、扩散。传统化疗的巨大毒副作用会造成全身毒性反应，很多病人并不是死于癌症本身，而是死于癌症治疗过程中的毒性反应和免疫功能全面受损。与西药相比，中药具有更高的安全性，中药巨大的资源宝库更是为挖掘抗肿瘤活性分子提供了有利条件。中医药采用毒副作用较低的天然药物，讲究扶正固本、辨证施治，其各种学说与现代免疫的防御、自稳、监视三方面功能具有一定共性，且在治疗肿瘤方面可以规避很多传统化疗药物的不足。因此，针对现有抗肿瘤药物毒副作用较大且对免疫功能有一定损伤的缺陷，开发一种高效、安全的中药抗肿瘤活性分子对人类社会具有显著的社会和经济效益前景。

灵芝(Ganoderma)为担子菌纲灵芝科(Ganodermataceae)真菌子实体的总称，俗称灵芝草，古称瑞草，是我国药学宝库中一种珍贵的药用真菌。灵芝自古以来就被视为可入药用的神奇珍品，其药用历史已有2000多年。古代的多部医学典籍都将灵芝列为上品，记载了灵芝滋补强壮、扶正培本的功效。目前国内分布的多种灵芝被民间广泛开发利用，已有23种灵芝作为药用真菌。喜热灵芝(Ganoderma calidophilum)称为“灵芝王”，主产于中国海南，因其常生长于竹林下，故海南民间又称之为“竹灵芝”。喜热灵芝具有多种药用和保健功效，海南黎族同胞将其泡酒用于保健和治疗胃痛，药用价值深入人心。由于其个头小，产量低，未能大量人工栽培，因而价格十分昂贵。受到经济利益的驱使，大批村民进山采集喜热灵芝，使喜热灵芝资源濒临灭绝，加之其药理活性基础创新研究滞后、活性成分的药用机制和成药价值尚未阐明，阻碍了其进一步研究和开发利用，无法实现高值化科学利用。因此，探讨喜热灵芝药用活性分子的药理作用机制，深入挖掘喜热灵芝活性分子并探讨其成药价值，对于开发我国自主知识产权的药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种三萜类化合物，以解决现有技术中具有抗癌活性的三萜类化合物种类少，抗癌活性不理想的问题。

本发明的目的之二在于提供一种三萜类化合物的制备方法和其在制备抗癌药物中的应用。

本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种三萜类化合物，所述化合物的结构通式为：

式(Ⅰ)中，R为COCH₃、COCH₂CH₃、COAr、CH₃、CH₂CH₃、CH₂Ar、β-D-glucose、β-D-galactose中的一种，其中，Ar为苯环。

进一步地，所述化合物的结构式为：

本发明的目的之二是通过以下技术方案实现的：一种上述三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

a、以海南喜热灵芝子实体为原料，用5～7倍于原料重量的50-100％乙醇回流提取3～4次，在60℃以下，将所得的提取液浓缩成稠膏状的粗提物；

b、将所得粗提物依次经正相硅胶色谱柱、反相C18色谱柱和Sephadex LH-20层析柱分离后得到化合物Ganodecalone A，Ganodecalone A的结构式为：

c、将Ganodecalone A溶于吡啶中，加入酸酐ROR，于室温反应8小时，反应产物经洗涤后结晶，得到Ganodecalone A的酯类修饰物；或者

将Ganodecalone A溶于DMF中，加入卤化物RI或RBr以及氢化钠，于室温反应4小时，反应产物经洗涤后结晶，得到Ganodecalone A的醚类修饰物；或者

将Ganodecalone A溶于干燥的二氯甲烷中，加入糖基三氯亚胺酯供体、分子筛和三氟甲磺酸三甲基硅酯，于室温反应2小时，反应产物经保护基脱除后，结晶纯化得到Ganodecalone A的苷类修饰物。

步骤c中R与式(Ⅰ)中一致。

进一步地，式(Ⅱ)所示结构化合物的制备方法包括以下步骤：

a、以海南喜热灵芝子实体为原料，用5～7倍于原料重量的50-100％乙醇回流提取3～4次，在60℃以下，将所得的提取液浓缩成稠膏状的粗提物；

b、将所得粗提物依次经正相硅胶色谱柱、反相C18色谱柱和Sephadex LH-20层析柱分离后得到化合物Ganodecalone A，Ganodecalone A的结构式为：

c、在氩气保护下，将Ganodecalone A和2,3,4,6-四-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯亚胺酯供体溶于无水CH₂Cl₂中，并向其中加入干燥的分子筛，于-30℃搅拌30min后，加入三氟甲基硅基三氟甲磺酸酯，继续搅拌4h后反应完全，三乙胺淬灭反应，经过滤、浓缩、快速柱层析后得到白色固体；

d、在在氩气保护下，将步骤c所得白色固体溶于甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中，然后加入甲醇钠，室温搅拌反应48h，反应完全后经酸性树脂中和、过滤，滤液经浓缩和快速柱层析后得到式(Ⅱ)所示结构的化合物。

一种上述三萜类化合物在制备抗癌药物中的应用。

所述抗癌药物的剂型为片剂、胶囊、溶液、悬浊液、注射液或滴注液。

所述抗癌药物包含制药学上可接受的辅料成分。

本发明的三萜类化合物在体外对人多种肿瘤细胞有抑制活性，其中，对人肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞抑制效果更为明显，IC₅₀较低。同时，本发明所述化合物对肿瘤细胞的抑制作用在哺乳动物范围内有一定的广谱性，对小鼠肿瘤细胞也存在一定的抑制作用。另外，本发明所述化合物对近正常细胞人肾上皮细胞293T几乎无抑制活性，证明其对正常细胞毒性较低，有极大的药用价值。

在本发明所述化合物与5-氟尿嘧啶对裸鼠人胃癌异位移植瘤小鼠对比试验中，本发明所述化合物能够有效抑制移植瘤体积的增长，且效果略优于阳性对照组(5-氟尿嘧啶)。给药并未对裸鼠的各器官造成损伤，未有任何不良反应，且裸鼠体重、进食量、血糖等指标并未发生明显改变。由此可见，本发明所述化合物对试验动物无毒副作用和药物依赖性。

在制备抗肿瘤药物的应用中，本发明所述的化合物可按本领域常规制剂方法制备成各种临床上常规制剂，例如，可以向本发明有效量化合物中加入药学上可接受辅料(例如崩解剂、润滑剂、黏合剂、分散剂等)，制备成各种口服药剂，本如片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂或口服液。

对于本领域技术人员来说，在知晓活性成分的情况下，可根据常规的制剂方法，轻易的制成各种药剂产品，同时在制备中所采用的辅料也为本领域所公知，如羧甲淀粉钠、蔗糖粉、蜂蜜、芝麻油等。

附图说明

图1.给药后裸鼠体重的变化图。

图2.肿瘤重量对比图。

图3.裸鼠肝脏重量对比图。

图4.裸鼠脾脏重量对比图。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明。

实施例1

本发明原料药为产自海南的喜热灵芝子实体，将子实体剪碎并研磨粉碎作提取用。

本发明所述制备方法中所采用的乙醇提取方法可以是渗漉法、浸渍法或回流提取法，作为优选，本发明制备方法优选乙醇回流提取原料药，操作步骤进一步优选为：

用5-7倍于原料药总重的50-100％乙醇，更优选为95％乙醇，回流提取原料药3-4次，每次60min。在60℃以下，将经乙醇提取后所得的滤液浓缩成粗提物稠膏。粗提物经正相硅胶色谱柱(CHCl₃/MeOH>3/MeOH>2O，50％-100％)后经Sephadex>3/MeOH>

将Ganodecalone A进一步反应得到本发明化合物如下：

式(Ⅰ)中，R为COCH₃、COCH₂CH₃、COAr、CH₃、CH₂CH₃、CH₂Ar、β-D-glucose、β-D-galactose中的一种，其中，Ar为苯环。

上述化合物根据26位碳上的氧原子所连基团不同主要有以下三种类型：

1、Ganodecalone A的酯类化合物：即Ganodecalone A第26位羟基经酰基化合成，包括26-O-acetyl-Ganodecalone A、26-O-propionyl-Ganodecalone A、26-O-benzoyl-Ganodecalone A。

2、Ganodecalone A的醚类化合物：即Ganodecalone A第26位羟基连接烷基，包括26-O-methyl-Ganodecalone A、26-O-ethyl-Ganodecalone A、26-O-benzyl-GanodecaloneA。

3、Ganodecalone A的苷类化合物：即Ganodecalone A第26位羟基连接糖基，包括26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A、26-O-β-D-galactopyranosyl-GanodecaloneA。

上述三类化合物分别由以下方法合成而得：取Ganodecalone A溶于吡啶中，加入一定酸酐ROR(R与式Ⅱ中一致)，于室温反应8小时，反应产物经弱酸弱碱水溶液洗涤后结晶等纯化手段得Ganodecalone A酯类修饰物；取Ganodecalone A溶于DMF中，加入一定卤化物RI或RBr(R与式Ⅱ中一致)和氢化钠，于室温反应4小时，反应产物经弱酸弱碱水溶液洗涤后结晶等纯化手段得Ganodecalone A醚类修饰物；取Ganodecalone A溶于干燥的二氯甲烷中，加入一定的糖基三氯亚胺酯供体(糖基与式Ⅱ中一致)、分子筛和三氟甲磺酸三甲基硅酯，于室温反应2小时，反应产物经保护基脱除后结晶纯化得Ganodecalone A苷类修饰物。

实施例2

本发明提供了一种抗癌活性好且溶解性能优良，更适宜制备水溶性抗癌药物的化合物26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A(Ganodecalone A水溶性较差)，其结构如下：

其合成方法如下：

(a)TMSOTf,CH₂Cl₂,-30℃,89％；(b)CH₃ONa,CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:1,95％。

在氩气保护下，将化合物1，即Ganodecalone A(91mg,0.20mmol)和2,3,4,6-四-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯亚胺酯供体2(280mg,0.26mmol，1.30equiv.)溶于4mL的无水CH₂Cl₂中，向其中加入干燥的分子筛(300mg)，-30℃搅拌30min后，加入三氟甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)(7μL,0.04mmol，0.2equiv.)，-30℃搅拌4h后TLC显示反应完全，三乙胺淬灭反应，经过滤、浓缩、快速柱层析得白色固体3(140mg,0.178mmol,89％)。

在氩气保护下，将化合物3(140mg,0.178mmol)溶于由6ml甲醇/二氯甲烷(MeOH:CH₂Cl₂＝1:1)的混合溶剂，然后加入甲醇钠(22mg,0.89mmol，5.0equiv.)，室温搅拌反应48h，TLC显示反应完全。反应经酸性树脂中和、过滤除去固体，滤液经浓缩和快速柱层析得白色固体4，即式(Ⅱ)所示结构化合物(105mg,0.1691mmol,95％)。[α]20_D＝-22.8(c>3)；¹H>3):δ5.35(s,1H),4.95(d,1H,J＝7.8Hz),4.61(dd,1H,J＝11.0,1.4Hz),4.41(dd,1H,J＝11.0,5.7Hz),4.27(d,1H,J＝7.8Hz),4.22(d,1H,J＝5.4Hz),4.04(dd,1H,J＝7.8,7.8Hz),4.02(d,1H,J＝14.2Hz),3.88(brs,1H,J＝5.4Hz),3.75(d,1H,J＝14.2Hz),2.99(m,1H),2.62(d,1H,J＝17.0Hz),2.50(m,1H),2.48(d,1H,J＝17.0Hz),2.44(m,1H),2.37(m,1H),2.27(m,1H),2.10(m,1H),1.97(m,1H),1.93(m,1H),1.75(m,1H),1.70(m,1H),1.65(overlap,2H),1.64(m,1H),1.64(s,3H),1.47(m,1H),1.39(m,1H),1.36(m,1H),1.13(s,3H),1.12(s,3H),1.11(s,3H),1.08(m,1H),1.05(s,3H),0.81(s,3H).¹³C>3):δ219.9,199.8,165.4,137.8,134.3,126.1,102.4,78.9,78.3,75.7,71.8,70.4,63.2,51.5,51.4,51.3,50.0,46.9,46.7,36.8,35.8,35.5,34.9,34.1,30.9,29.0,27.6,26.8,25.6,24.3,20.3,18.9,18.5,18.1,16.7,13.3。

HRMS(ESI):[M+H]⁺,C₃₆H₅₇O₈,计算值：617.4048；实测值：617.4061。

实施例3

化合物Ganodecalone A及26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A对体外肿瘤细胞的生长抑制活性。

检测方法如下：

(1)细胞铺板

将细胞进行传代培养，当细胞融合率达到约80％时，弃去旧培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)冲洗去除残留后加入1mL 0.5‰(w/v)胰酶将细胞消化，当大约80％的细胞变成圆形时加入含血清培养基停止消化，用移液枪吹吸瓶壁，尽量将贴壁细胞吹下，将细胞悬液加入离心管置于离心机中，1000rpm离心5min，弃掉上清，用新鲜培养基重悬细胞，用移液枪吹吸尽量使细胞分散，计数，将细胞悬液稀释为5×104个/mL，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，留下6个孔加入等量的培养基作为调零孔。

(2)加药处理

培养细胞约18h左右，显微镜下观察细胞状态稳定后，将DMSO溶解的50mM化合物使用培养基按照二倍稀释法分别依次稀释至终浓度100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM，每浓度组加入药物的体积用DMAO补齐至共2μL/mL，每孔三个重复，用等体积的DMSO作对照以消除DMSO对细胞的影响。

(3)MTT检测

在药物处理48h后，在避光条件下每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，置于二氧化碳培养箱中反应4h后，每孔加入100μL SDS-HCl(10％)，置于二氧化碳培养箱中过夜孵育。第二天用酶标仪检测在波长570nm各孔的OD值。根据检测结果计算抑制率和IC50值，试验重复三次并计算检测结果的标准偏差，试验结果见表1(Mean±SD)。

表1

由表1可知，化合物Ganodecalone A与26-O-β-D-glucopyranosyl-GanodecaloneA对人多种肿瘤细胞均有抑制活性，其中，对人肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞抑制效果更为明显，IC50较低。同时，化合物Ganodecalone A与26-O-β-D-glucopyranosyl-GanodecaloneA对小鼠黑色素瘤细胞也有明显的抑制作用，证明两种化合物对肿瘤细胞的抑制作用在哺乳动物范围内有一定的广谱性。另外，两者对近正常细胞人肾上皮细胞293T几乎无抑制活性，其抑制IC50大于100μΜ，证明两种化合物对正常细胞毒性较低，有极大的药用价值。

实施例4

化合物Ganodecalone A与26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A对裸鼠体内肿瘤细胞生长的抑制活性。

1、试验动物：三周龄BALB/cA-nu免疫缺陷型裸鼠60只，购自北京华阜康实验动物有限公司，雌雄各半，平均体重为14±2g。

2、试验环境：裸鼠饲养于SPF级环境中，使用独立通气笼具系统(IVC)雌雄分笼饲养，饲养温度为20～26℃、温差最大不能超过4℃，饲养湿度为40～65％，换气次数≥15次/时。饲养裸鼠前笼具经75％酒精擦拭并紫外照射灭菌处理，饲养裸鼠用水、垫料需高温高压灭菌，饲料为C_O60鼠维持饲料(无菌)购自北京华阜康实验动物有限公司，裸鼠购买后需要适应性饲养一周才可进行试验。

3、裸鼠接瘤试验：

(1)肿瘤细胞的富集

选取Ganodecalone A(试验中简称GDA)与26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A(试验中简称Glu-GDA)体外抑制活性较好的人胃癌细胞MGC-803进行富集培养。当细胞融合率达到约80％时，弃去旧培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)冲洗去除残留后加入1mL0.5‰(w/v)胰酶将细胞消化，当大约80％的细胞变成圆形时加入含血清培养基停止消化，用移液枪吹吸瓶壁，尽量将贴壁细胞吹下，将细胞悬液加入离心管置于离心机中，1000rpm离心5min，弃掉上清，用少量PBS重悬细胞，用移液枪吹吸尽量使细胞分散，计数约需5000万个细胞，并使用PBS将细胞悬液稀释为10⁷个/mL，将富集好的细胞置于冰上，并于1h内接种于裸鼠体内。

(2)裸鼠-人胃癌异位移植瘤接种

选择裸鼠右侧腹背部进行异位接瘤，因为该位置不易发生摩擦，能有效防止肿瘤被磨破。于超净工作台中，按照每只裸鼠10⁶个/100μL的量进行接种，使用注射器将细胞悬液接种于裸鼠皮下，每只鼠接种100μL。接瘤后，每隔三日称量裸鼠体重并记录每只裸鼠健康状况。

4、荷瘤裸鼠的给药治疗：

(1)荷瘤裸鼠的分组

接种肿瘤一周后，剔除未成瘤的裸鼠。将剩下的裸鼠进行分组，分为六组，每组8只左右，并使每组裸鼠的肿瘤体积数值平均值基本一致、数值分布基本一致。分成的六组分别为：空白对照组、阳性对照组(5-氟尿嘧啶，30mg/kg)、低浓度GDA给药组(Ganodecalone A，30mg/kg)、高浓度GDA给药组(Ganodecalone A，150mg/kg)、低浓度Glu-GDA给药组(26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A，30mg/kg)、高浓度Glu-GDA给药组(26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A，150mg/kg)，每组裸鼠均编号。

(2)荷瘤裸鼠的腹腔注射给药

对四组小鼠分别进行隔日腹腔注射给药处理。为增加Ganodecalone A在生理盐水中的溶解度，选用10％DMSO、2％Tween-80溶解药物后，再用相应体积的生理盐水超声并涡旋溶解制成稳定、均一的悬液，26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A使用同样的溶解方法溶解。阳性对照选用5-氟尿嘧啶，空白对照组则补加生理盐水，溶解药物的步骤均相同。药物溶解后1h内注射入裸鼠体内，每只裸鼠注射200μL，每两天注射一次。

(3)给药治疗后各生理指标的检测

给药时同样每隔三日测量、计算裸鼠的瘤体积，并对每组裸鼠进行称重。每组裸鼠自接瘤后，体重变化结果见图1(Mean±SEM，箭头代表开始给药)。

5、荷瘤裸鼠的处死及肿瘤的剥离与称重：

将各组裸鼠进行断椎处死，速度要快，将处死后的每组裸鼠进行拍照。在超净工作台内进行每组裸鼠肿瘤的剥离，剥离前使用75％的酒精浸泡裸鼠15s，用棉花擦拭裸鼠荷瘤处，再用刀片划开肿瘤附近的表皮层，用镊子扯开裸鼠肿瘤上方的表皮，最后用剪刀或镊子挑出肿瘤。注意：剥离裸鼠肿瘤的整个过程中用到的纱布、刀片、镊子均需高温高压灭菌。

挑出的肿瘤按顺序置于无菌纱布上，在超净工作台内阴干约15min，然后于天平上称重。各肿瘤重量统计见图2所示(Mean±SEM，*P＜0.05vs comtrol，**P＜0.01vscomtrol)。

6、裸鼠的解剖与病理学检查：

解剖并打开裸鼠的胸、腹腔，给药组分别与对照组比较，观察裸鼠的心、肝、肾、脾、肺、胃、十二指肠、大肠、小肠、肾上腺和生殖器等脏器有无发生变化。剥离各组裸鼠的肝脏、脾进行观察称重，结果见图3和图4所示(Mean±SEM)，评估给药对裸鼠产生的影响。

由以上结果可知，荷裸鼠在给药后，阳性对照组与给药组裸鼠肿瘤的体积均小于对照组；剥离肿瘤后，阳性对照组与给药组裸鼠肿瘤的重量均低于对照组，给药组肿瘤重量与对照组相比，有显著性差异，给药组裸鼠肿瘤重量低于阳性对照组。然而，本发明试验中设计的低浓度组与高浓度组肿瘤体积与重量相比，却无显著性差异，这可能与裸鼠对药物的吸收有关。

荷瘤裸鼠在给药后，各组裸鼠的体重并未发生明显的差异变化，各组裸鼠的进食量也未有明显改变；解剖各组裸鼠后，未发现裸鼠的脏器有异常，各组裸鼠的肝、脾重量亦无显著性差异。由此可见，化合物Ganodecalone A和26-O-β-D-glucopyranosyl-Ganodecalone A对裸鼠毒性较低，有药用开发价值。