一种罗丹明类酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针

摘要

本发明提供了一种罗丹明类酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针，属于有机合成领域。本发明以4‑吗啉基苯甲醛和罗丹明6G酰肼为反应物，通过缩合反应即可得到本发明的罗丹明类酰腙衍生物；本发明的罗丹明类酰腙衍生物具有式I所示结构，对pH非常敏感，在pH>4.0时无明显荧光发射，pH<4.0时发射明显的绿色荧光，且在pH3.0～4.0范围产生突跃；并且本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物能够靶向细胞溶酶体，可用于荧光区分正常细胞和肿瘤细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及有机合成的技术领域，特别涉及一种罗丹明类酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针。

背景技术

荧光传感器是监测阳离子、阴离子和小分子的强大工具，具有高灵敏度，操作简便以及实时和在线检测的优点。肿瘤细胞的检测与标记具有非常重要的意义，有助于阐述癌症相关过程及便于临床诊断。相比正常细胞，pH值降低是肿瘤细胞的重要特征。利用肿瘤细胞(pH<4.0)与正常细胞(4.0<pH<6.0)溶酶体pH差异而实现肿瘤细胞标记是pH荧光探针设计的有效策略之一。

但现有溶酶体靶向肿瘤细胞标记荧光探针合成复杂，成本较高，并且使用时需加入大量有机溶剂助溶，助溶剂的体积比需要大于10％才能将作为荧光探针的化合物有效溶解，限制了其进一步应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种罗丹明类酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针。本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物对pH值非常敏感，在不同的pH值条件下有不同的荧光发射，可以实现正常细胞和肿瘤细胞的荧光区分，且使用方便，仅需极少量有机溶剂(体积比为0.5％)助溶。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种罗丹明类酰腙衍生物，所述罗丹明类酰腙衍生物具有式I所示结构：

本发明提供了上述方案所述罗丹明类酰腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将罗丹明6G酰肼、4-吗啉基苯甲醛和醇类溶剂混合进行缩合反应，得到具有式I所示结构的罗丹明类酰腙衍生物。

优选的，所述醇类溶剂为乙醇。

优选的，所述罗丹明6G酰肼和4-吗啉基苯甲醛的摩尔比为1:1～1.1。

优选的，所述罗丹明6G酰肼的物质的量和醇类溶剂的体积比为0.01～0.02mol：0.3～0.6L。

优选的，所述缩合反应在回流搅拌条件下进行；所述缩合反应的压力为常压，时间为3～5h。

优选的，所述缩合反应完成后还包括：对缩合反应液进行后处理，所述后处理包括以下步骤：

将缩合反应液冷却至室温，使固体析出，过滤后对滤渣进行洗涤，得到具有式I所示结构的罗丹明类酰腙衍生物。

本发明提供了上述方案所述的罗丹明类酰腙衍生物或上述方案所述制备方法制备的罗丹明类酰腙衍生物作为pH荧光探针的应用。

本发明提供了一种用于区分肿瘤细胞和正常细胞的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的罗丹明类酰腙衍生物或上述方案所述制备方法制备的罗丹明类酰腙衍生物。

本发明提供了一种具有式I所示结构的罗丹明类酰腙衍生物。本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物对pH异常敏感，低酸度下以螺环结构存在，不表现荧光，高酸度下螺环打开，发射强荧光；并且本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物结构中存在溶酶体定位基吗啉，使得该衍生物作为荧光探针时能够靶向细胞溶酶体，实现正常细胞和肿瘤细胞的荧光区分。

本发明提供了上述方案所述罗丹明类酰腙衍生物的制备方法，本发明以4-吗啉基苯甲醛和罗丹明6G酰肼为反应物，通过缩合反应即可得到本发明的罗丹明类酰腙衍生物。本发明提供的制备方法步骤简单，原料易得。

本发明提供了上述方案所述的罗丹明类酰腙衍生物作为pH荧光探针的应用。实施例结果表明，本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针在pH>4.0时无明显荧光发射，pH<4.0时发射明显的绿色荧光，且在pH3.0～4.0范围产生突跃，说明其可以作为高酸度pH荧光探针；并且其发光效果不会受到阳离子，阴离子和氨基酸的干扰。

本发明还提供了一种区分肿瘤细胞和正常细胞的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的罗丹明类酰腙衍生物。使用本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针与商用溶酶体定位染料进行共定位实验，结果表明，本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针能够特异性定位于活细胞溶酶体，能够有效区分正常细胞和肿瘤细胞。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物的晶体结构图；

图2为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物的质谱谱图；

图4为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物在不同磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中的荧光光谱图；

图5为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物在pH值为2.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图；

图6为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物在pH值为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图；

图7为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物在pH值为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图；

图8为本发明实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针与商用溶酶体定位染料LysoTracker Red对正常细胞239T、肿瘤细胞HpeG2和Hela进行共染的细胞共焦荧光图像。

具体实施方式

本发明提供了一种罗丹明类酰腙衍生物，所述罗丹明类酰腙衍生物具有式I所示结构：

本发明提供了上述方案所述罗丹明类酰腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将罗丹明6G酰肼、4-吗啉基苯甲醛和醇类溶剂混合进行缩合反应，得到具有式I所示结构的罗丹明类酰腙衍生物。

在本发明中，所述罗丹明6G酰肼和4-吗啉基苯甲醛的摩尔比优选为1:1～1.1，更优选为1:1；所述醇类溶剂优选为乙醇；所述罗丹明6G酰肼的物质的量和醇类溶剂的体积比优选为0.01～0.02mol：0.3～0.6L，更优选为0.01mol：0.3～0.5L。

本发明优选先将罗丹明6G酰肼溶解在醇类溶剂中，再将4-吗啉基苯甲醛加入溶液中。在本发明的具体实施例中，优选向6G酰肼4-吗啉基苯甲醛和醇类溶剂的混合液中滴加2～3滴乙酸，然后再进行缩合反应，在本发明中，所述乙酸作为催化剂可以催化反应的快速进行。

在本发明中，所述缩合反应优选在回流搅拌条件下进行；所述缩合反应的压力优选为常压，时间优选为3～5h，更优选为3.5～4.5h，进一步优选为4h。

在本发明中，所述缩合反应的反应式如式Ⅱ所示：

在本发明中，所述缩合反应完成优选后还包括：对缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将缩合反应液冷却至室温，使固体析出，过滤后对滤渣进行洗涤，得到具有式I所示结构的罗丹明类酰腙衍生物。

在本发明中，所述洗涤滤渣用洗涤剂优选为乙醇；所述过滤优选为减压过滤；本发明对所述减压过滤和洗涤的具体操作方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的减压过滤和洗涤方法即可。

在本发明中，所述洗涤后还优选包括将洗涤产物进行重结晶，所述重结晶用溶剂优选为乙腈；本发明对所述重结晶的具体操作方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的重结晶方法即可。

本发明提供了上述方案的罗丹明类酰腙衍生物或上述方案所述制备方法制备的罗丹明类酰腙衍生物作为pH荧光探针的应用。本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针在4.0<pH<6.0时无明显荧光发射，pH<4.0时发射明显的绿色荧光，且在pH3.0～4.0范围产生突跃。

本发明还提供了一种用于区分肿瘤细胞和正常细胞的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的罗丹明类酰腙衍生物。在本发明中，所述罗丹明类酰腙衍生物结构中包括溶酶体定位基吗啉，因而该衍生物作为荧光探针时能够特异性定位于细胞溶酶体，肿瘤细胞(pH<4.0)与正常细胞(4.0<pH<6.0)溶酶体存在pH差异，不同的pH条件下本发明的罗丹明类酰腙衍生物会产生不同的荧光发射，从而实现肿瘤细胞和正常细胞的区分。本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物在作为荧光探针应用时直接溶解于溶剂中即可，所述溶剂优选包括主溶剂和助溶剂，所述主溶剂优选为pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，助溶剂优选为DMSO，所述溶剂中助溶剂的体积比优选为0.5％，本发明提供的罗丹明类酰腙衍生物仅需要极少量的有机溶剂助溶，其溶解性明显优于本领域中现有的溶酶体靶向肿瘤细胞标记荧光探针，使用更加方便。

下面结合实施例对本发明提供的一种罗丹明类酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将428mg罗丹明6G酰肼溶于30mL乙醇中，再加入191mg 4-吗啉基苯甲醛，常压下滴加2滴乙酸催化回流搅拌3h，冷却至室温，析出固体，减压过滤。将滤渣用乙醇洗涤，得到白色固体即为目标产物，目标产物的产率为89％。

将所得产物用乙腈进行重结晶，对所得重结晶产物进行单晶衍射分析，确定所得产物的晶体结构，所得结果如图1所示；晶体结构显示所得罗丹明类酰腙衍生物以乙腈合物形式存在。

对制得的罗丹明类酰腙衍生物进行核磁共振分析，结果如下：

¹H>6),δ(ppm):8.59(s,1H,CH＝N),7.86-7.88(dd,1H,Ar-H),7.52–7.59(m,2H,Ar-H),7.24-7.26(d,2H,Ar-H),7.00-7.02(s,2H,Ar-H),6.87-6.89(d,2H,Ar-H),6.32(s,2H,Ar-H),6.16(s,2H,Ar-H),5.04-5.07(t,2H,2NH),3.68-3.70(t,4H,2CH₂),3.09-3.16(m,8H,4CH₂),1.84(s,6H,2CH₃),1.18-1.22(t,6H,2CH₃)，具体核磁图谱如图2所示；

对制得的罗丹明类酰腙衍生物进行了质谱分析：ESI-MS:m/z＝301.6587([M+2H]²⁺)；602.3149([M+H]⁺)；1225.6054([2M+Na]⁺)(calc.1225.60)，具体质谱谱图如图3所示。

实施例2

将实施例1制备的罗丹明类酰腙衍生物在不同pH值的缓冲溶液中进行荧光性质测定，步骤如下：

(1)将实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物在不同pH值(1.0～6.0)磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(含体积比为0.5％的DMSO)中配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/L的溶液，采用荧光光谱仪分别进行荧光光谱分析(激发波长为480nm)，所得的荧光光谱图见图4。通过图4可以看出，本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针在4.0<pH<6.0时无明显荧光发射，反之pH<4.0时发射明显的绿色荧光，且在pH3.0～4.0范围产生突跃，说明其可以作为高酸度pH荧光探针。

将实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物分别在pH值为2.0、4.0和6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(含体积比为0.5％的DMSO)中配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/L的溶液，向溶液中加入不同的金属离子(Ag⁺,Al³⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Hg²⁺,K⁺,Mg²⁺,Na⁺,Ni²⁺,Pb²⁺和Zn²⁺，控制金属离子在溶液中的浓度为5×10^-5mol/L)、阴离子(AcO^-,Br^-,Cl^-,ClO₄^-,CN^-,CO₃^2-,F^-,HCO₃^-,HPO₄^2-,H₂PO₄^-,HSO₃^-,HSO₄^-,I^-,N₃^-,PO₄^3-,S^2-,SCN^-,SO₃^2-和SO₄^2-,控制阴离子在溶液中的浓度为5×10^-4mol/L)以及部分氨基酸(精氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,甘氨酸,组氨酸,同型半胱氨酸和赖氨酸，控制氨基酸在溶液中的浓度为5×10^-4mol/L)，采用荧光光谱仪分别进行荧光光谱分析(激发波长为480nm)。

所得的荧光光谱图见图5～7，其中图5为罗丹明类酰腙衍生物在pH值为2.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(含体积比为0.5％的DMSO)中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图，图6为罗丹明类酰腙衍生物在pH值为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(含体积比为0.5％的DMSO)中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图，图7为罗丹明类酰腙衍生物在pH值为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(含体积比为0.5％的DMSO)中溶解后加入不同金属离子、阴离子和氨基酸的荧光发射光谱图。通过图5～7可以看出，本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针在pH＝2.0,4.0和6.0时的荧光发射基本不受上述共存阳离子，阴离子和氨基酸的干扰。

实施例3

测试罗丹明类酰腙衍生物作为荧光探针在区分肿瘤细胞和正常细胞方面的应用，步骤如下：

选择293T细胞，HpeG2和HeLa肿瘤细胞作为实验材料，将其与本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物(将罗丹明类酰腙衍生物配制成探针溶液，浓度为1×10^-5mol/L，溶剂为pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，含体积比0.5％DMSO)和溶酶体商用染料LysoTrackerRed在37℃条件下共染30min，使用Olympus>

图8中，a～e为对正常细胞293T进行共染的荧光成像图：a为探针绿色通道荧光成像图；b为LysoTrackerRed红色通道荧光成像图；c为明场图；d为明场图和荧光图叠加图；e为红色通道和绿色通道相关图。

f～j为对肿瘤细胞Hep G2进行共染的荧光成像图：f为探针绿色通道荧光成像图；g为LysoTracker Red红色通道荧光成像图；h为明场图；i为明场图和荧光图叠加图；j为红色通道和绿色通道相关图。

k～o为对肿瘤细胞HeLa进行共染的荧光成像图：k为探针绿色通道荧光成像图；l为LysoTrackerRed红色通道荧光成像图；m为明场图；n为明场图和荧光图叠加图；o为红色通道和绿色通道相关图。

通过图8可以看出，HpeG2和HeLa肿瘤细胞发射强绿光，而293T细胞的只有轻微的背景荧光，说明本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物能够有效区分正常细胞和肿瘤细胞。红色通道和绿色通道相关图表明本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物与LysoTrackerRed在293T正常细胞，HpeG2和HeLa肿瘤细胞的共染指数分别为98.21％,83.25％和99.18％，说明本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物能够特异性定位于活细胞溶酶体。

由以上实施例可以看出，本发明提供罗丹明类酰腙衍生物对pH非常敏感，可作为pH荧光探针，且能够靶向细胞溶酶体，实现正常细胞和肿瘤细胞的荧光区分，且在应用时无需有机溶剂助溶；本发明提供的制备方法步骤简单，成本低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。