DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞

摘要

本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。本发明将人外周血单核细胞通过基因改造，使之成为可在体外持续培养的永生化细胞株。本发明通过IL‑4和GM‑CSF诱导PBMC，并转染SV40大T抗原和MYC‑ER融合蛋白基因，从而获得永生化DC细胞株。这种永生化的DC细胞株可在体外长时间大量培养，能有效提呈抗原并在体外使T细胞激活并迅速扩增。该永生化的树突状细胞株可用于提呈肿瘤或病原体特异性抗原，为肿瘤及传染性疾病的免疫治疗提供一个方便、高效的平台。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。

背景技术

免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的一种治疗方法。

肿瘤细胞或病原体的感染会激活人体内的T淋巴细胞产生免疫应答以抵抗这些疾病。T淋巴细胞的激活需要一类称为抗原提呈细胞(APC)的参与。抗原提呈细胞主要包括树突状细胞(DC)，巨噬细胞和B淋巴细胞，其中树突状细胞是最为重要，也是最为高效的抗原提呈者。抗原提呈细胞把来自于肿瘤或病原体的抗原蛋白经过消化，处理后，以小肽的形式将这些抗原提呈到细胞表面，一旦这些抗原信号被T淋巴细胞识别，后者就被激活并扩增。大量活化的T细胞会攻击并杀死肿瘤细胞或被病原体感染的细胞，从而发挥免疫的功能。

在一些慢性疾病如肿瘤或病原体引发的慢性炎症疾病中，T淋巴细胞的免疫功能会随着时间逐渐钝化，失去对肿瘤细胞的杀伤效果。此外，肿瘤组织中浸润的T淋巴细胞往往含量很少，达不到足够的杀伤效果，这些是造成肿瘤免疫逃逸的主要原因。

在理想情况下，一个良好的免疫治疗策略应该满足以下条件：第一，在较低的效应细胞/肿瘤细胞比例(E:T比值)时，即具有较好的抗肿瘤效果，由此最大限度地减少注入患者的细胞数量，可同时降低成本和风险；第二，“现成化”模式，抗肿瘤免疫细胞可源于健康捐献者且不引起移植物抗宿主病并发症(GVHD)，从而提供经济、有效的治疗，并且显著减少病人等待时间；第三，尽量规避基因改造可能带来的毒副作用，CAR-T细胞经过基因工程改造，可长时间存留在病人体内，存在未知风险；第四，免疫细胞质量的优化，虽然激活免疫细胞的方法有多种，但是通过树突状细胞激活免疫细胞符合机体自然规律，被认为是最好的方法之一。

当前临床上针对肿瘤的免疫治疗主要基于来自病人自体的T淋巴细胞，包括T淋巴细胞的分离、抗原特异性T细胞的体外激活、扩增及回输等四个步骤。其中抗原特异性T细胞群的扩增是该治疗策略中极为关键也是极具挑战性的步骤。目前常用的手段有以下两种1)利用CD3，CD28抗体和IL12 混合物刺激T细胞。该方法为T细胞提供了激活、扩增、生存三种关键信号，但是这些信号的呈现方式与体内APC的抗原自然呈递过程完全不同，可能导致T细胞扩张速度慢，功能受限或功能失调；2)利用病人自体分离的DC 细胞或经由单核细胞刺激分化而来的DC细胞来激活、扩增T细胞。这种方法与体内的抗原提呈方式相同，但受限于病人血液中极低的DC细胞含量，无法满足扩大化的临床需求。而且这些DC细胞在体外无法长期生存，往往短期培养后就会死亡。

因此，如何在体外以尽可能接近自然的方式提呈肿瘤或病原体抗原来激活具有靶标特异性的T淋巴细胞，并实现其快速、大量的扩增是目前T细胞免疫治疗领域的一个亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。本发明提供一种通过IL-4和GM-CSF诱导PBMC，并转染SV40大T抗原和MYC-ER融合蛋白基因，从而获得永生化DC细胞株的方法；这种永生化的DC细胞株可在体外长时间大量培养，能有效提呈抗原并在体外使T细胞激活并迅速扩增。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种DNA分子，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(IV)或(V) 所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅰ)、编码猿猴空泡病毒40的大T抗原的核苷酸序列和Myc截短基因进入位点的核苷酸序列；

(Ⅱ)、与如(Ⅰ)所述的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(Ⅲ)、如(Ⅰ)所述的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列；

(IV)、如(Ⅰ)所述的核苷酸序列的互补序列；

(V)、与(Ⅰ)～(IV)任一项所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA分子还包括(Ⅵ)、(Ⅶ)、(Ⅷ)、 (Ⅸ)或(Ⅹ)所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅵ)、内部核糖体、小鼠雌激素受体激素结合结构域、BamHI限制性内切酶酶切位点或Acc651限制性内切酶酶切位点中的一个片段或多个片段；

(Ⅶ)、与如(Ⅵ)所述的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(Ⅷ)、如(Ⅵ)所述的核苷酸序经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列；

(Ⅸ)、如(Ⅵ)所述的核苷酸序列的互补序列；

(Ⅹ)、与(Ⅵ)～(Ⅸ)任一项所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述BamHI酶切位点的核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示；所述编码猿猴空泡病毒40的大T抗原的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述内部核糖体进入位点的核苷酸序列如SEQ ID No.3 所示；所述Myc截短基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述小鼠雌激素受体激素结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述Acc651酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了具有所述DNA分子的载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为以pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 Vector为基础并包含目标基因序列慢病毒的质粒。

本发明还提供了所述的DNA分子或所述的载体在制备永生化细胞中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述永生化细胞为永生化树突状细胞。

本发明还提供了一种细胞，转化有所述的载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞为永生化细胞；所述永生化细胞的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述永生化细胞为永生化树突状细胞。

本发明还提供了所述的细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获取所述的DNA分子：

步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了所述永生化DC细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获取所述的DNA分子：

步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

步骤3：用IL-4和GM-CSF诱导PBMC，获得宿主细胞；

步骤4：取所述重组表达载体转化宿主细胞，获得所述永生化DC细胞。

本发明还提供了所述的细胞或所述的制备方法制得的细胞在制备肿瘤和 /或感染性疾病的免疫治疗的药物中的应用。

体外正常诱导的树突状细胞不进行增殖，无法建立细胞系。针对这一问题，可以采用在其基因组整合病毒蛋白或者肿瘤抗原的方法来实现建系。我们采用了猿猴空泡病毒40的大T抗原和编码转录因子的调节基因Myc来作为调节DC功能和提高DC的体外扩增能力的分子工具，同时我们对Myc截短肽C末端插入小鼠雌激素受体激素结合结构域，以更好的实现永生化细胞系的建立和对该细胞生长速度的调控。使用FICOLL分离液从外周血分离单个核细胞(PBMC)，使用CD3/CD28磁珠阴选的方法去除淋巴细胞后通过2 小时差速贴壁筛选得到单核细胞。经过IL-4和GM-CSF共刺激后得到未成熟的树突状细胞。使用包装了SV40大T抗原和Myc-ER基因的慢病毒对DC 进行转染，在转染后的细胞需要持续加入tamoxifen，以刺激转染后表达的雌激素受体结合区域，进一步使DC扩增。在成功建系的细胞持续生长超过6个月后，细胞表达CD11c，CD123，CD205；同时还表达DC成熟和激活分子，包括CD83,CD80,CD86,CD70,CCR7,和HLA-DR。此株细胞在普通的培养条件下呈悬浮生长(如图1所示)。

本发明的有益效果在于：

1、提供了一种体外以外周血单核细胞为来源的永生化树突状细胞转染方法。

2、该方法得到的树突状细胞株具有连续生长和传代6个月以上的能力，并且持续具有树突状细胞的细胞表型。

3、该方法使树突状细胞获得可转染病原体或者肿瘤抗原基因或抗原肽基因并持续表达的能力。

4、该方法可诱导产生特异性CTL对病原体感染的细胞或肿瘤细胞进行杀伤。

5、该方法可以用于筛选有效的特异性TCR。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示通过流式细胞术检测显示细胞活率为88.8％(DAPI拒染检测)，细胞表达CD11c，CD123，CD205；同时还表达DC成熟和激活分子，包括CD83, CD80,CD86,CD70,CCR7,和HLA-DR，活细胞主体显示为DC细胞(98.5％)；

图2示pLVX-EF1α-AcGFP1-N1质粒(目的基因插入至BamHI与Acc651 间)和ViraPower^TMPackaging>

图3示琼脂糖凝胶电泳，验证质粒大小正确；

图4示包装质粒中的GAG(图4A),POL基因(图4B)的PCR产物凝胶电泳检测图，显示结果为阳性且片段大小正确；

图5示DC中的目的基因中的猿猴空泡病毒40的大T抗原的QPCR产物电泳结果，在永生化DC中可以检测到猿猴空泡病毒40的大T抗原mRNA表达；而在在阴性对照A549和DC-CTL当中，检测不到猿猴空泡病毒40的大T抗原 mRNA；

图6示特异性抗原肽TERT表达水平QPCR检测结果；显示DC转染TERT 基因后，其表达水平高于阳性对照A549细胞系；

图7示流式细胞术鉴定永生化DC诱导产生的CTLs细胞免疫表型，提示CTL中含有NK,NKT,CD8+T等细胞亚群；

图8示永生化DC-CTL对A549靶细胞杀伤试验结果；

图8A永生化DC-CTL对A549靶细胞16小时杀伤试验结果；示永生化 DC-CTL在靶细胞：效应细胞1:10条件下，杀伤活性达到98.1，效应细胞1:2.5 条件下，杀伤活性达到83.7％；

图8B示永生化DC-CTL对A549靶细胞4小时杀伤试验结果；永生化 DC-CTL在靶细胞：效应细胞1:10条件下，杀伤活性达到91.7％，效应细胞 1:1.25条件下，杀伤活性达到64.1％，而PBMC无杀伤效果。

具体实施方式

本发明公开了一种DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞的技术方案中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

针对永生化目标DNA进行载体构建，对含包装质粒和目标DNA质粒的感受态细胞进行建库。

通过overlap PCR对DNA片段进行逐一拼接或通过Oligo Microarray随机拼接后筛选合成剪切前DNA目的片段(片段一至六的连续片段)，包含猿猴空泡病毒40的大T抗原、内部核糖体进入位点、Myc截短基因、小鼠雌激素受体激素结合结构域以及BamHI和Acc651限制性内切酶酶切点位，酶切后获得目标DNA。

片段一：BamHI酶切位点序列(如SEQ ID No.1所示)；

片段二：猿猴空泡病毒40的大T抗原(如SEQ ID No.2所示)；

片段三：内部核糖体进入位点(如SEQ ID No.3所示)；

片段四：Myc截短基因(如SEQ ID No.4所示)；

片段五：小鼠雌激素受体激素结合结构域(如SEQ ID No.5所示)；

片段六：Acc651酶切位点序列(如SEQ ID No.6所示)；

永生化细胞的DNA(如SEQ ID No.7所示)。

使用限制性内切酶BamHI和Acc651分别对pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 Vector质粒和酶切前目的片段进行酶切，37度，四小时反应后将酶切产物使用0.8％agrose胶电泳并切胶纯化。将切后目的片段和质粒序列使用T4DNA 连接酶于冰上进行3小时连接，，建立以pLVX-EF1α-AcGFP1-N1Vector为基础并包含目标基因序列慢病毒的质粒，连同ViraPower^TMPackaging>

用5mol/LNaOH调pH至7.0，5mL/管分装，121℃高压灭菌15min，冷却至室温后4℃冷藏备用；

若配置固体LB培养基则再加入10-15g/L琼脂粉(Agar)，按上述方法调 pH并灭菌之后，待冷却至50-60℃时，在超净工作台内，按比例加入浓度为 100mg/mL的氨苄抗生素，在培养基冷凝之前摇匀并倒入预先灭菌的培养皿中，根据培养需要确定培养基厚度。

从-80℃冰箱中取出感受态细胞(stbl3)，迅速置于冰上，待完全融化(约 5-10min；

在超净工作台内，向每管感受态细胞中加入0.1ug质粒，轻弹混匀；

再次置于冰上45-60min；42℃热击90sec；迅速放回冰上2min；

在超净工作台内，向每管中加入800uLLB液体培养基，用封口膜封闭管口，于37℃，

250rpm振荡培养45-60min；

取50-200uL培养物均匀涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上；

37℃恒温培养箱中过夜培养(12-16h)。

单克隆挑取：观察上述LB平板上菌落生长情况，选择光滑饱满的单克隆，挑取至含相应抗生素的5mL液体LB培养基中，37℃，250rpm培养至 OD600＝0.6-0.8。

通过菌液PCR或质粒提取方法进行鉴定。

若鉴定结果显示，菌种正确，则在超净台中，依次取300uL 50％甘油和 700uL细胞培养物至冻存管中(×2支)，混匀，放入相应冻存盒，-80℃保存。

支存储于Master Cell Bank中，1支存储于Working Cell Bank中。

从Working Cell Bank中，取出冻存管，用接种环在冰面上刮下少许冰渣，进行划线，并迅速将样品管放入冻存盒中。

当Working Cell Bank中的样品使用完或失效后，用Master Cell Bank中的种子进行划线、培养、制备Working Cell Bank样品。

大规模Cell Bank(6-15支)建立将单克隆挑取：观察上述LB平板上菌落生长情况，选择光滑饱满的单克隆，挑取至含相应抗生素的5mL液体LB 培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6-0.8。

在超净台中，分别取300uL 50％甘油至11个无菌1.5mL离心管，依次加入700uL细胞培养物，混匀，标记，放入相应冻存盒，-80℃保存。

1支存储于Master Cell Bank中，其他存储于Working CellBank中。

从Working CellBank中，取出冻存管，在室温或37℃融化，接种 100-200mLLB培养基。

当Working Cell Bank中的样品使用完或失效后，用Master Cell Bank中的种子进行划线、培养、制备Working Cell Bank样品。

实施例2 对含有永生化目标RNA序列的病毒载体进行包装、浓缩及滴度测定

1.中提或大提试剂盒对含有pLP1(Gag/Pol),pLP2(Rev),pLP-VSVG (VSVG)以及目标基因慢病毒质粒的感受态细胞库分别进行质粒提取，测定质粒浓度及A260/280比值，A260/280比值应该处于1.8-1.9之间。取少量质粒样品(～500ng)进行琼脂糖凝胶电泳，验证质粒大小正确。(如图3所示，中间条带符合4180bp，8889bp，5821bp)。

并对质粒中的GAG,POL基因进行PCR产物凝胶电泳检测(如图4(A)、图4(B)所示)。

2.质粒转染前一天，消化融合度约80％的293T细胞。取20ul细胞悬液与80ul台盼蓝染液混合，滴加于血球计数板上计数。将5-6x 106个293T 细胞悬浮于10ml培养液(高糖DMEM+10％FBS，无抗生素)并接种到10cm 的培养皿中。第二天细胞将长至大约90-95％的融合度，适合质粒转染。

3.第二天，观察293T细胞是否长至大约90％的融合度，假如细胞数目过少(细胞与细胞之间有大量空间)，不建议继续。假如细胞状态合适，吸掉细胞培养液，加入9ml新鲜的无抗生素培养液(高糖DMEM+10％FBS)。换液后细胞放回培养箱培养。

4.在一个1.5ml离心管中加入800μl的I培养液 (Invitrogen)，再加入36ul的转染试剂，注意转染试剂一定要直接加入I溶液中，不要加到塑料管壁上。颠倒混匀后于室温静置5分钟。另取一个1.5ml离心管，加入200ulI培养液，再分别加入3μg pLP1,3μg pLP2,3μg pLP-VSVG，3μg包含目标DNA序列的慢病毒质粒(总共12μg质粒，添加顺序随意，用中提或大提的质粒)，混匀后静置。5分钟后将质粒混合液加入转染试剂混合液(总体积1ml左右)，缓慢吹打混匀后于室温静置20分钟。

5.将1ml DNA-转染试剂复合物逐滴均匀加到已换过液的293T细胞培养板中(总体积10ml)，前后左右摇动培养皿混匀，放入37℃，5％CO2 培养箱过夜培养。第二天，将细胞培养液吸走，加入无抗生素的10ml新鲜培养液，放入37℃，5％CO2培养箱培养。注意换液时要缓慢，以免冲起细胞。转染48小时后可继续观察细胞形态变化，细胞融合现象会更加普遍，细胞与细胞的边界变的模糊。转染72小时后收集病毒。收集之前观察培养基颜色，正常应为橘黄色(主黄偏橘)。如培养基颜色深红或者纯黄(如黄色枪头)，则包装很可能失败或病毒滴度很低。将培养皿中的培养液上清(不需要收集细胞)收集到15ml离心管中(大约8-9ml)，用0.45μm的过滤膜过滤去处细胞碎片。没有过滤膜的话，可以3000rpm，4℃离心15minutes后收集上清。

6.或取300ul无血清DMEM培养基于EP管内，分别取5ug lentipak+5ug Lenti-HLA置于EP管内，混匀，室温放置10min。按照质粒量：转染试剂 (superfect)为1:4的比例加入40ul转染试剂，轻柔混匀，室温静置15min。轻轻吸取EP管内液体滴加入293细胞液面上，轻柔摇晃混匀。转染6小时后，更换为8ml Pro293^TMa-CDM^TMMedium继续培养。24小时后，收取上清液至50ml离心管内，4℃保存。向细胞中继续补加10mlPro293^TMa-CDM^TM>TMa-CDM^TMMedium培养。72小时后收取最后批次的病毒上清，与24小时和48小时的病毒液混合，按照5ml/管分装于15ml>

7.使用PEG法、超速离心法或凝胶层析法对病毒进行浓缩

1)PEG-it^TM沉淀法：往收集到的慢病毒上清液中加入1/4体积的>TM病毒沉淀液(Cat.#LV810A-1/LV825A-1，System>

2)超速离心法浓：将收集到的病毒上清液以66,549x g的速度，4℃离心2小时，弃掉上清，将病毒沉淀重悬于PBS或无血清培养基，-80℃长期保存，分装避免反复冻融。

3)使用30KD超滤管进行浓缩富集后，使用填料微球内孔径100nm的凝胶层析柱进行分离，使用PBS收集填料微球间隙体积排空后1-2馏分再次使用30KD超滤管进行富集，-80℃长期保存，分装避免反复冻融。

实施例3 慢病毒滴度测定

3.1在收集48小时慢病毒时，消化293细胞，按照5×104个细胞/ 孔接种于6孔板内，体积为2mL，尽量保证细胞在孔底均匀分布。两块6孔板用于一种病毒滴度测定。将6孔板置于37℃培养箱内培养过夜，使次日早上细胞数量达到1×10⁵个/孔。注：细胞接种数量必须要精确，因为该数值要用于滴度计算。

3.2收集并混匀24，48及72小时的病毒液。每块6孔板中的5孔将加入病毒稀释液，剩下的一孔用作对照，另一块6孔板做同样处理，作为重复试验。稀释比例为病毒液：培养基＝1:3，1:9，1:27，1:81，1:243。具体操作：取50ml离心管1支，移液管移取35mL含血清培养基，并向培养基内加入35ul浓度为10mg/ml的聚凝胺溶液，混匀后成为稀释培养基。稀释方法:A＝2mL病毒原液+6mL稀释培养基+2ul浓度为10mg/ml的聚凝胺溶液；B＝2mL A+6mL稀释培养基；C＝2mL B+6mL稀释培养基；D＝2mL C+6mL稀释培养基；E＝2mL D+6mL稀释培养基。轻柔吸弃两块6孔板内5 孔内的细胞培养基，分别加入2mL A液、B液、C液、D液及E液。对照孔保持不变。放入培养箱内培养。

3.3病毒感染24小时后，吸弃各孔内培养基。分别加入2ml新鲜培养基，置于培养箱内继续培养2天。

3.4吸弃培养基，每孔加入1mL PBS轻柔洗涤一次细胞，弃掉PBS。每孔加入500ul浓度为0.25％的胰酶，在37℃培养箱孵育5min。向各孔内加入0.5mL含血清培养基终止反应。1mL枪头吹散细胞并将其转移至EP 管内，1200rpm，离心5min。弃上清，1mL PBS洗涤细胞一次。1200rpm。离心5min。

3.5弃上清，500ul PBS重悬细胞，并将细胞悬液转移到流式分析管内，上机分析含绿色荧光的细胞比例。

3.6计算病毒滴度。滴度＝1×105 293细胞×％of EGFP×稀释倍数。注：为了计算的精确性，两个连续稀释比例的孔内细胞GFP细胞占比应该接近1:3。这种线性关系在小于15％的细胞被感染上时是能够观察到的。

病毒滴度为1.72×10⁶。

表1

实施例4

通过外周静脉采血获得PBMC，并诱导成为moDC，进而通过转染猴肾病毒40大T抗原基因和MYC-ER融合基因使其永生化。在此基础上进一步转染并表达了肿瘤特异性抗原。

抽取少量外周血(10ml)，送第三方检测其HLA表型，根据其表型在分子生物学实验室克隆相应的慢病毒HLA表达载体，并在GMP实验室完成慢病毒包装和对永生化DC细胞的感染。

4.1无菌环境下抽取患者全血标本40ml置于抗凝管中备用；

4.2取两支50ml离心管，预先将淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque1077，加入50ml无菌离心管，20ml/管(分离单个核细胞)；

4.3 10mL移液管吸取抗凝全血，缓慢加在Ficoll-Hypaque1077上(方法：将离心管倾斜45°，在Ficoll液面以上1cm处，缓慢注入稀释血，不要打乱液面界面)，体积比为1:1，400g(2000rpm/min)，室温离心30min (离心时，要将刹车档打到“off”档，确保其以最慢速度停止离心，否则离心后不能分层)；

4.4离心结束后，可见液面由上至下分为四层，最上层为血浆层，第二层为白细胞层，第三层为Ficoll液层，最下层为血细胞层。用5mL移液管将最上层血浆层尽量吸弃后，用1mL枪头轻轻插入到白细胞层，沿着管壁吸取该层细胞至一干净的50mL离心管内。每管加生理盐水至30ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤3次，除去血小板和分离介质(室温1500r/min，5min， 1次，1000r/min，10min，1次，800r/min，10min，1次)。弃去上清，用Lonza X-VIVO15无血清培养液重悬计数。

将1×107个PBMC与100μL抗CD3的磁珠(Invitrogen)在4℃环境中孵育30min。将在磁力作用下未连接到磁珠上的细胞被吸出，进行细胞计数和活力检测后以每平方厘米1×107个的密度将细胞接种于三层培养瓶中，进行 2小时差速贴壁培养，培养结束后，取出培养瓶；小心旋转震荡培养瓶，除去未贴壁细胞。用平衡至室温的PBS洗培养瓶3次，每次50mL。将三层培养瓶中的PBS倒净，得到单核细胞。

未成熟的树突状细胞培养：

单核细胞中加入135mL 1640培养基，15mL血清替代物，1500U/mL IL-4 和3000U/mL GM-CSF，小心震荡后放入37℃ 5％CO2条件下培养，培养时间100小时，于第四天向每瓶细胞中补充15mL1640培养基，1.5mL血清替代物，1500U/mL IL-4和3000U/mL GM-CSF混合液；

细胞计数，2×10⁶个树突状细胞细胞用PHA(5μg/mL)处理24小时。

将含目的核酸序列的慢病毒按照MOI20的剂量感染刺激后的PBMC细胞，同时加入6μg/mL聚凝胺共培养16小时。

将细胞离心弃上清，新鲜培养基重悬细胞后，加入100units/ml IL2继续培养。

在经历约6个月的凋亡淘汰后，仍保留持续生长能力的细胞存活下来，通过一系列抗体经FACS检测其免疫表型。

这类细胞经流式细胞术检测发现细胞群不表达CD3，表达CD83，CD80， CD86，CD11c，CD123和HLA-DR阳性，符合树突状细胞的表型特征。

实施例5 慢病毒感染永生化-DC细胞并筛选获得稳定表达特异性抗原的细胞株

5.1收集2ml永生化DC细胞混悬液至15ml离心管内，1200rpm，离心5min。

5.2弃上清，用2ml新鲜培养基重悬细胞，取100ul细胞悬液于EP 管中，另向

EP管中加入100ul台盼蓝，混匀后滴加于血球技术板上计数，接种 1×105个细胞至6孔板的一个孔内，并记录细胞悬液体积。

5.3根据慢病毒滴度测定结果，按照MOI＝20，计算加入细胞中的病毒液体积，补齐培养基至2ml，同时向孔内加入2ul浓度为10mg/ml的聚凝胺溶液，保证其终浓度为10ug/ml，37℃培养箱内培养。

52.424小时后，将细胞收集于15ml离心管内，1200rpm，5min。

5.5弃上清，2ml新鲜培养基重悬永生化DC细胞并放入新的孔内培养，向细胞内添加1ug/ml puromycin继续培养2天。

5.6将细胞收集于15ml离心管内，1200rpm，5min。

5.7弃上清，3ml新鲜培养基重悬永生化DC细胞并放入新的孔内培养并扩增放大。

5.8病毒感染1周后，收集部分细胞，通过流式细胞术鉴定特异抗原表达情况。

5.9病毒感染1周后，收集部分细胞，通过流式细胞术鉴定特异抗原表达情况。

对DC中的目的基因中的猿猴空泡病毒40的大T抗原进行了检测，结果表明，在永生化DC中可以检测到猿猴空泡病毒40的大T抗原mRNA表达；而在在阴性对照A549和DC-CTL当中，检测不到猿猴空泡病毒40的大T 抗原mRNA。(如图5所示)。

表2

在永生化DC的基础上使用同实施例4、5的方式继续转染了特异性抗原肽TERT。并对其表达情况进行了QPCR检测，结果显示其表达量高于阳性对照A549细胞系，A549细胞系表达量仅为其66.18％，(P＜0.01)(如图6所示)。

表3

实施例6

6.1.1抽取PBMC供体志愿者1ml外周血并存储在EDTA抗凝采血管中充分混匀。

6.1.2 4℃运输至博奥晶典进行HLA-A低分型检测，并选择血清型为 HLA-A0201志愿者1位入组作为实验组、对照组的PBMC供体。选择血清型非HLA-A0201志愿者1位入组作为PBMC阴性对照1组供体。

6.1.3抽取入组志愿者10ml外周血并存储在EDTA抗凝采血管中充分混匀。

6.1.4将血液样品转移至50ml离心管中加入平衡至室温的PBS至35ml。

6.1.5向每管预先已加入15mL Ficoll-Paque分离液的50mL离心管中缓慢加入35mL稀释的血样。

6.1.6室温下1800转/分钟，离心30分钟，离心机加速参数设置为1，降速参数设置为0。

6.1.7分别将每个离心管中液体的中间层转移至一个新的50ml离心管中。

6.1.8加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下1200转/分钟离心10分钟。弃去上清，用1.0mL PBS重悬细胞团块。

6.1.9加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下1000转/分钟离心10分钟。弃去上清，加入1.0mLPBS重悬细胞团块。

6.1.10加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下800转/分钟离心10分钟。弃去上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞团块。

6.1.11使用RPMI1640培养基和10％FBS培养体系，向离心管中加入 1.0mL完全培养基，重悬细胞团块。

6.1.12将细胞悬液用2ml血清移液管测量体积，重悬后取10ul进行计数。

6.2效应细胞的制备复苏HLA-A0201永生化DC，使用RPMI1640培养基和10％FBS培养体系，调整细胞密度为2x10⁵/ml并接种于25瓶中，每天加入200U/ml>5/ml(约2-3天)。

6.2.2使用RPMI1640培养基和10％FBS培养体系，将PBMC以 1-2x10⁶/well接种于6孔板中，将永生化DC按1：500比例加入孔中，并保证每孔细胞悬液体积为2ml。

6.2.3Day1-Day3每天加入IL-2 200U/ml进行扩增，培养基变黄时进行半量换液。

6.2.4Day5将细胞转移至25培养瓶并补足培养基至6mL，每天加入IL-2 200U/ml进行扩增至Day9，培养基变黄时进行半量换液。

6.2.5Day9将细胞转移至75培养瓶并补足培养基至15mL，每天加入IL-2 200U/ml进行扩增至Day14，培养基变黄时进行半量换液或增加培养基。

6.2.6Day14将CTL细胞进行流式检测分析。流式细胞术鉴定永生化 DC诱导产生的CTLs细胞免疫表型，提示CTL中含有NK,NKT,CD8+T等细胞亚群。(如图7所示)

6.3通过将荧光素报告基因转染至靶细胞后，使用CTL对靶细胞进行杀伤以验证杀伤效果在永生化DC与PBMC混合共培养后的第10天，复苏2株表达荧光素酶的肿瘤细胞用于CTLs细胞活性检验。保证在第15天时，靶细胞已经经过一次消化传代并进入对数生长期。

6.3.2使用5％胰酶消化靶细胞，终止消化后，细胞混悬液10ml转移至15mL 离心管中，常温，1200rpm，离心5min。

6.3.3弃去上清，用2mL RPMI1640培养基重悬细胞团块，样品进行细胞计数。

6.3.4按照2.5×10⁴/250ul调整肿瘤细胞密度，接种250ul肿瘤细胞悬液于24>

6.4杀伤试验细胞处理贴壁2小时后，按照靶细胞：效应细胞1:10至1:1.25 调整CTLs细胞密度进行接种。保证加入每孔的细胞悬液体积为250uL。

6.4.2阴性对照组加入血清型为HLA-A2且与效应细胞各组等量的PBMC，保证加入每孔的细胞悬液体积为250uL。

6.4.3空白对照加入250uL RPMI1640培养基。

6.4.4将效应细胞与靶细胞共培养16或4小时。

6.5荧光检测使用注射用水将5×Reporter Lysis Buffer按照H₂O：RLB＝4：>

6.5.2吸弃培养基上清，使用10ml血清移液管加入PBS，轻微震荡，吸弃 PBS，再次加入PBS洗涤，确保所有悬浮的细胞及细胞碎片均被清除。

6.5.3每孔加入100μL细胞裂解液，冰上裂解细胞约2小时。

6.5.4打开多功能酶标仪

6.5.5将裂解产物转移至1.5mL离心管内，标记样品编号，进行12000rpm， 5min离心。

6.5.6将每个1.5mL离心管取20μL上清液依次加入96孔酶标板检测孔内。

6.5.7使用100μL手持单道移液器依次向酶标板检测孔内加入100μL Luciferase底物，吹打3次后，立刻检测荧光强度。

6.5.8依次检测各孔荧光强度，确保每个样品加入底物后在10秒内检测。

6.5.9计算CTL细胞对肿瘤细胞杀伤率。杀伤活性％＝[1-(E+T组OD值)/T 组OD值]×100％

E:效应细胞，T：靶细胞，E+T：效应细胞+靶细胞

杀伤试验结果：

永生化DC-CTL对A549靶细胞16小时杀伤试验显示，永生化DC-CTL 在靶细胞：效应细胞1:10条件下，杀伤活性达到98.1，效应细胞1:2.5条件下，杀伤活性达到83.7％。(如图8A所示)

永生化DC-CTL对A549靶细胞4小时杀伤试验显示，永生化DC-CTL 在靶细胞：效应细胞1:10条件下，杀伤活性达到91.7％，效应细胞1:1.25条件下，杀伤活性达到64.1％，而PBMC无杀伤效果，显示该CTL具有特异性杀伤能力。(如图8B所示)

表4 16小时和4小时杀伤效率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京惠大生物科技有限公司

<120> DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞

<130> MP1811221

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> BamHI酶切位点(restriction site of BamHI )

<400> 1

ttcttatgga tcc 13

<210> 2

<211> 2126

<212> DNA

<213> 猿猴空泡病毒40的大T抗原(Large T-antigen of simian vacuolar virus40)

<400> 2

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420

gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480

atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540

gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600

cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660

ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720

ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780

gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840

aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900

atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960

tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020

gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080

ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140

tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200

atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260

tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320

gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380

ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440

gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500

ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560

tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620

tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680

gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740

tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800

gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860

atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920

gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980

acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040

catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100

acacctcccc ctgaacctga aacata 2126

<210> 3

<211> 574

<212> DNA

<213> 内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site)

<400> 3

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574

<210> 4

<211> 1317

<212> DNA

<213> Myc截短基因(Myc truncated gene)

<400> 4

atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacga ctcggtgcag 60

ccgtatttct actgcgacga ggaggagaac ttctaccagc agcagcagca gagcgagctg 120

cagcccccgg cgcccagcga ggatatctgg aagaaattcg agctgctgcc caccccgccc 180

ctgtccccta gccgccgctc cgggctctgc tcgccctcct acgttgcggt cacacccttc 240

tcccttcggg gagacaacga cggcggtggc gggagcttct ccacggccga ccagctggag 300

atggtgaccg agctgctggg aggagacatg gtgaaccaga gtttcatctg cgacccggac 360

gacgagacct tcatcaaaaa catcatcatc caggactgta tgtggagcgg cttctcggcc 420

gccgccaagc tcgtctcaga gaagctggcc tcctaccagg ctgcgcgcaa agacagcggc 480

agcccgaacc ccgcccgcgg ccacagcgtc tgctccacct ccagcttgta cctgcaggat 540

ctgagcgccg ccgcctcaga gtgcatcgac ccctcggtgg tcttccccta ccctctcaac 600

gacagcagct cgcccaagtc ctgcgcctcg caagactcca gcgccttctc tccgtcctcg 660

gattctctgc tctcctcgac ggagtcctcc ccgcagggca gccccgagcc cctggtgctc 720

catgaggaga caccgcccac caccagcagc gactctgagg aggaacaaga agatgaggaa 780

gaaatcgatg ttgtttctgt ggaaaagagg caggctcctg gcaaaaggtc agagtctgga 840

tcaccttctg ctggaggcca cagcaaacct cctcacagcc cactggtcct caagaggtgc 900

cacgtctcca cacatcagca caactacgca gcgcctccct ccactcggaa ggactatcct 960

gctgccaaga gggtcaagtt ggacagtgtc agagtcctga gacagatcag caacaaccga 1020

aaatgcacca gccccaggtc ctcggacacc gaggagaatg tcaagaggcg aacacacaac 1080

gtcttggagc gccagaggag gaacgagcta aaacggagct tttttgccct gcgtgaccag 1140

atcccggagt tggaaaacaa tgaaaaggcc cccaaggtag ttatccttaa aaaagccaca 1200

gcatacatcc tgtccgtcca agcagaggag caaaagctca tttctgaaga ggacttgttg 1260

cggaaacgac gagaacagtt gaaacacaaa cttgaacagc tacggaactc ttgtgcg 1317

<210> 5

<211> 960

<212> DNA

<213> 小鼠雌激素受体激素结合结构域(Hormone binding domain of MouseEstrogen receptor)

<400> 5

cgaaatgaaa tgggtgcttc aggagacatg agggctgcca acctttggcc aagccctctt 60

gtgattaagc acactaagaa gaatagccct gccttgtcct tgacagctga ccagatggtc 120

agtgccttgt tggatgctga accgcccatg atctattctg aatatgatcc ttctagaccc 180

ttcagtgaag cctcaatgat gggcttattg accaacctag cagataggga gctggttcat 240

atgatcaact gggcaaagag agtgccaggc tttggggact tgaatctcca tgatcaggtc 300

caccttctcg agtgtgcctg gctggagatt ctgatgattg gtctcgtctg gcgctccatg 360

gaacacccgg ggaagctcct gtttgctcct aacttgctcc tggacaggaa tcaaggtaaa 420

tgtgtggaag gcatggtgga gatctttgac atgttgcttg ctacgtcaag tcggttccgc 480

atgatgaacc tgcagggtga agagtttgtg tgcctcaaat ccatcatttt gcttaattcc 540

ggagtgtaca cgtttctgtc cagcaccttg aagtctctgg aagagaagga ccacatccac 600

cgtgtcctgg acaagatcac agacactttg atccacctga tggccaaagc tggcctgact 660

ctgcagcagc agcatcgccg cctagctcag ctccttctca ttctttccca tatccggcac 720

atgagtaaca aaggcatgga gcatctctac aacatgaaat gcaagaacgt tgtgcccctc 780

tatgacctgc tcctggagat gttggatgcc caccgccttc atgccccagc cagtcgcatg 840

ggagtgcccc cagaggagcc cagccagacc cagctggcca ccaccagctc cacttcagca 900

cattccttac aaacctacta catacccccg gaagcagagg gcttccccaa cacgatctga 960

<210> 6

<211> 13

<212> DNA

<213> Acc651酶切位点(Restriction sites of Acc651)

<400> 6

ggtaccggtt ctg 13

<210> 7

<211> 4977

<212> DNA

<213> 永生化DC细胞(Immortalized DC cells)

<400> 7

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420

gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480

atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540

gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600

cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660

ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720

ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780

gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840

aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900

atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960

tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020

gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080

ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140

tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200

atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260

tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320

gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380

ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440

gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500

ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560

tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620

tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680

gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740

tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800

gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860

atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920

gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980

acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040

catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100

acacctcccc ctgaacctga aacatacccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 2160

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 2220

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 2280

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 2340

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 2400

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 2460

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 2520

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 2580

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 2640

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 2700

atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacga ctcggtgcag 2760

ccgtatttct actgcgacga ggaggagaac ttctaccagc agcagcagca gagcgagctg 2820

cagcccccgg cgcccagcga ggatatctgg aagaaattcg agctgctgcc caccccgccc 2880

ctgtccccta gccgccgctc cgggctctgc tcgccctcct acgttgcggt cacacccttc 2940

tcccttcggg gagacaacga cggcggtggc gggagcttct ccacggccga ccagctggag 3000

atggtgaccg agctgctggg aggagacatg gtgaaccaga gtttcatctg cgacccggac 3060

gacgagacct tcatcaaaaa catcatcatc caggactgta tgtggagcgg cttctcggcc 3120

gccgccaagc tcgtctcaga gaagctggcc tcctaccagg ctgcgcgcaa agacagcggc 3180

agcccgaacc ccgcccgcgg ccacagcgtc tgctccacct ccagcttgta cctgcaggat 3240

ctgagcgccg ccgcctcaga gtgcatcgac ccctcggtgg tcttccccta ccctctcaac 3300

gacagcagct cgcccaagtc ctgcgcctcg caagactcca gcgccttctc tccgtcctcg 3360

gattctctgc tctcctcgac ggagtcctcc ccgcagggca gccccgagcc cctggtgctc 3420

catgaggaga caccgcccac caccagcagc gactctgagg aggaacaaga agatgaggaa 3480

gaaatcgatg ttgtttctgt ggaaaagagg caggctcctg gcaaaaggtc agagtctgga 3540

tcaccttctg ctggaggcca cagcaaacct cctcacagcc cactggtcct caagaggtgc 3600

cacgtctcca cacatcagca caactacgca gcgcctccct ccactcggaa ggactatcct 3660

gctgccaaga gggtcaagtt ggacagtgtc agagtcctga gacagatcag caacaaccga 3720

aaatgcacca gccccaggtc ctcggacacc gaggagaatg tcaagaggcg aacacacaac 3780

gtcttggagc gccagaggag gaacgagcta aaacggagct tttttgccct gcgtgaccag 3840

atcccggagt tggaaaacaa tgaaaaggcc cccaaggtag ttatccttaa aaaagccaca 3900

gcatacatcc tgtccgtcca agcagaggag caaaagctca tttctgaaga ggacttgttg 3960

cggaaacgac gagaacagtt gaaacacaaa cttgaacagc tacggaactc ttgtgcgcga 4020

aatgaaatgg gtgcttcagg agacatgagg gctgccaacc tttggccaag ccctcttgtg 4080

attaagcaca ctaagaagaa tagccctgcc ttgtccttga cagctgacca gatggtcagt 4140

gccttgttgg atgctgaacc gcccatgatc tattctgaat atgatccttc tagacccttc 4200

agtgaagcct caatgatggg cttattgacc aacctagcag atagggagct ggttcatatg 4260

atcaactggg caaagagagt gccaggcttt ggggacttga atctccatga tcaggtccac 4320

cttctcgagt gtgcctggct ggagattctg atgattggtc tcgtctggcg ctccatggaa 4380

cacccgggga agctcctgtt tgctcctaac ttgctcctgg acaggaatca aggtaaatgt 4440

gtggaaggca tggtggagat ctttgacatg ttgcttgcta cgtcaagtcg gttccgcatg 4500

atgaacctgc agggtgaaga gtttgtgtgc ctcaaatcca tcattttgct taattccgga 4560

gtgtacacgt ttctgtccag caccttgaag tctctggaag agaaggacca catccaccgt 4620

gtcctggaca agatcacaga cactttgatc cacctgatgg ccaaagctgg cctgactctg 4680

cagcagcagc atcgccgcct agctcagctc cttctcattc tttcccatat ccggcacatg 4740

agtaacaaag gcatggagca tctctacaac atgaaatgca agaacgttgt gcccctctat 4800

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