法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-11-05
授权
授权
2019-04-05
实质审查的生效 IPC(主分类):A61L26/00 申请日:20181120
实质审查的生效
2019-03-12
公开
公开
技术领域
本发明属于水凝胶技术领域,具体涉及一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶及其制备方法。
背景技术
慢性创伤包括创伤性溃疡、糖尿病足等,是指皮肤组织在一个月内不能开始愈合或在三个月内不能完成愈合的结构性损伤。如今,慢性创伤已经成为公众健康的严重威胁。估计全球有超过七千万患者遭受慢性创伤。在美国,每年用于慢性创伤的治疗费用超过五百亿美元,给社会带来巨大的资金负担。此外,因为损伤长时间不愈合,慢性创伤很容易受细菌感染且80%的感染涉及细菌生物膜(Bacterial biofilm)。细菌生物膜一旦形成,产生的感染很难治疗,因为生物膜中含有多糖,DNA,肽聚糖和磷脂的细胞外聚合能保护其包裹的细菌,防止抗生素和宿主免疫反应对细菌的杀灭作用。
水凝胶是一种新型的创伤敷料,由于它特有的优点如能提供一个局部湿润环境,吸收组织分泌液,并且不粘附新生的组织,已经被尝试用于治疗慢性创伤。为了治疗慢性创伤感染,人们尝试将不同的抗生素组装进水凝胶中,但是其对细菌生物膜的杀灭效率仍较低。此外,抗生素在感染部位的长期应用会引起细菌的耐药性并且产生毒副作用。为了克服上述使用抗生素的局限性,有着广谱抗菌能力的铜离子和银离子被引入水凝胶中,但是这种策略也有很多的局限性,比如颜色深暗(二价铜离子),细胞毒性,以及由于光敏性(银离子)造成的保存困难等。因此研发不含抗生素且具有消除细菌生物膜能力的水凝胶具有重大意义。
发明内容
针对现有技术中的上述不足,本发明提供了一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶及其制备方法,可有效解决现有辅料杀灭细菌生物膜能力不足,含有抗生素易导致细菌耐药性等问题。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)将水溶性聚合物加入氧化石墨烯分散液中,于50-100℃条件下持续搅拌1-10h,使其充分溶解在氧化石墨烯中;
(2)将步骤(1)所得物静置6-24h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融1-10次,诱导聚合物结晶,提高其力学强度;
(4)将步骤(3)所得物浸入含有还原剂的水溶液中进行还原反应,使氧化石墨烯(GO)还原为还原氧化石墨烯(rGO);
(5)将步骤(4)所得物浸入稀土离子水溶液中进行交联反应,反应温度为10-50℃,反应时间为6-48h;
(6)将步骤(5)所得物浸入无菌PBS溶液或水中反复浸泡,除去未交联的稀土离子以及未反应的还原剂等物质,最终制得水凝胶。
进一步地,步骤(1)中水溶性聚合物为海藻酸钠、聚乙烯醇、壳聚糖中的至少一种。
进一步地,步骤(3)中冻融温度为0℃以下,每次冻融时间为1-24h,此操作可诱导聚合物结晶,提高凝胶机械性能。
进一步地,步骤(4)中还原剂为VC、茶多酚、多巴胺或亚硫酸钠。
进一步地,步骤(4)中反应温度为10-50℃,反应时间为6-48h。
进一步地,步骤(5)中稀土离子为Tb3+、Ce3+、La3+、Sm3+、Gd3+或Yb3+,其浓度均为0.1M-2M。
本发明提供的用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶及其制备方法,具有以下效果:
(1)将本发明制得的水凝胶是一种柔性材料,无细胞毒性,具有较强的抗细菌黏附和蛋白粘附的能力。水凝胶中的石墨烯能与稀土离子产生协同抗菌作用,具有强烈的清除细菌生物膜的能力,是一种优良的伤口敷料材料。
(2)本发明制得的水凝胶,没有使用抗生素,可有效避免因使用抗生素造成的细菌抗药性,同时避免抗生素产生的各种毒副作用。
(3)本发明制备过程简单,制得的水凝胶可以适用于糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、压力性溃疡等现有技术难以治愈的感染性慢性伤口的治疗,也可以适用于其他体表感染的治疗。
附图说明
图1为水凝胶的制备流程图。
图2为实施例1中的水凝胶抗蛋白吸附结果。
图3为实施例1中的水凝胶抗细菌粘附结果。
图4为实施例1中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
图5为实施例1中的水凝胶细胞毒性结果。
图6为实施例1中的水凝胶的Tb3+释放结果。
图7实施例1中的水凝胶动物实验伤口愈合的结果。
图8为实施例2中的水凝胶抗蛋白吸附结果。
图9为实施例2中的水凝胶抗细菌粘附结果。
图10为实施例2中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
图11为实施例2中的水凝胶细胞毒性结果。
图12为实施例2中的水凝胶的Ce3+释放结果。
图13为实施例3中的水凝胶抗蛋白吸附结果图。
图14为实施例3中的水凝胶抗细菌粘附结果图。
图15为实施例3中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
图16为实施例3中的水凝胶细胞毒性结果图。
图17为实施例4中的水凝胶抗细菌粘附结果。
图18为实施例4中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
图19为实施例5中的水凝胶抗细菌粘附结果。
图20为实施例5中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
图21为实施例6中的水凝胶抗细菌粘附结果。
图22为实施例6中的水凝胶细菌生物膜清除结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤(制备流程图见图1):
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于95℃条件下搅拌4h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融两次,每次在-20℃条件下冷冻10h,然后在室温下融化3h;
(4)将步骤(3)所得物浸入2mg/mL维生素C溶液中,室温反应24h,将GO还原为rGO,得到PVA-SA-rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入0.2M的TbCl3溶液中,室温反应24h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶PVA-SA-rGO-Tb。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL水中,混匀,得PVA-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融两次,每次在-20℃条件下冷冻10h,然后在室温下融化3h;
(4)将步骤(3)所得物浸入0.2M的TbCl3溶液中,室温反应24h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶得到PVA-SA-Tb。对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、力学性能
采用Instron 4310万能材料测试系统表征水凝胶的力学性能,结果显示,水凝胶的杨氏模量高达250kPa,断裂伸长率高达205%,显示了很好的柔韧性,可以经受使用敷料或更换敷料时产生的应力。
2、透水率
将一定尺寸的湿态水凝胶覆盖到含有一定PBS的离心管中,于37℃和湿度为60%的环境中放置24h,计算离心管中PBS蒸发的质量。
计算公式如下:
WVTR=(Wi-Wt)/A t
式中,Wi和Wt为离心管中初始和结束后PBS的质量;
A为离心管口的面积;
t为测试时间。
通过计算可得,水凝胶的透水率为70g>-1m-2。理想的伤口敷料的透水率范围为4至390g>-1m-2,因此,本实施例制备的水凝胶的透水率满足伤口敷料的使用要求。
3、蛋白质吸附
将已溶胀平衡的水凝胶放入96孔板中,设置三个平行样,每孔加入200μL含BSA的PBS溶液(浓度为0.5mg/mL),37℃条件下震荡24h后,将孔内液体吸出,并用PBS溶液冲洗样品3次以去除其表面物理吸附的蛋白质。使用BCA试剂盒定量分析所得溶液中的蛋白质浓度,使用酶标仪在562nm处读取光密度值,通过与标准曲线对照并计算得到水凝胶表面吸附蛋白质的含量,其结果如图2所示。
由图2可知,与商用水凝胶敷料(Hydrosorb)对比,本实施例制备的水凝胶吸附的BSA的量显著降低,表现出了更好的抗蛋白吸附的性能,有利于防止更换敷料时对新生组织产生的二次伤害。
4、抗细菌粘附性
将实施例1和对比例1所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图3所示。
由图3可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Tb3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
5、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例1和对比例1)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图4可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Tb3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力提高一个数量级以上。
6、细胞毒性
采用体外细胞实验测试水凝胶(实施例1和对比例1)的细胞毒性,具体过程为:
将小鼠成纤维细胞L929以5×104个/cm2的密度种植在24孔板上,培养24h。采用直接接触法和浸提液法测试水凝胶的细胞毒性,结果如图5所示,两种测试方法均表明,制备的水凝胶无细胞毒性。
7、Tb3+的释放
将实施例1和对比例1制备的水凝胶样品放置于清水中,释放的Tb3+含量通过电感耦合等离子体光谱仪测定。如图6上图所示,在水凝胶中加入rGO后,Tb3+的释放增加了1900%。进一步,为了模拟实际情况,我们将制备的水凝胶放置在长满细菌生物膜的琼脂板上,测量水凝胶在接触细菌生物膜时的释放。如图6下图所示,在水凝胶中加入rGO后,Tb3+的释放增加了500%。这些结果显示,水凝胶中加入rGO能显著增加Tb3+的释放,提高水凝胶的抗菌性能。
8、大鼠伤口愈合实验
以糖尿病大鼠为动物模型测试制备的水凝胶样品对感染性慢性伤口愈合的促进作用。
实验使用SD大鼠(体重200g左右),尾静脉注射链脲霉素(每天45mg/kg)直至大鼠空腹血糖值高于16.7mM。在大鼠背部脊柱两侧切割伤口,并在每个伤口处加入200μL 1×107CFU/mL的金色葡萄球菌菌液,以引起感染。伤口面积使用透明计算纸测定。伤口面积变化结果如图7所示。本实施例制备的水凝胶,能显著促进感染性慢性伤口的愈合。
实施例2
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)取0.3g海藻酸钠和1.5g水溶性壳聚糖,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于60℃条件下搅拌8h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融6次,每次在-20℃条件下冷冻5h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入2mg/mL茶多酚溶液中,室温反应12h,将GO还原为rGO,得到CS-SA-rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入1M的CeCl3溶液中,室温反应16h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡4h,制得水凝胶CS-SA-rGO-Ce。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和1.5g水溶性壳聚糖(CS),溶解于20mL水中,混匀,得CS-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融6次,每次在-20℃条件下冷冻5h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入1M的CeCl3溶液中,室温反应16h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡4h,制得水凝胶得到CS-SA-Ce。
对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、力学性能
采用Instron 4310万能材料测试系统表征水凝胶的力学性能,结果显示,水凝胶的杨氏模量为120kPa,断裂伸长率高达130%,显示了很好的柔韧性,可以经受使用敷料或更换敷料时产生的应力。
2、透水率
将一定尺寸的湿态水凝胶覆盖到含有一定PBS的离心管中,于37℃和湿度为60%的环境中放置24h,计算离心管中PBS蒸发的质量。
计算公式如下:
WVTR=(Wi-Wt)/A t
式中,Wi和Wt为离心管中初始和结束后PBS的质量;
A为离心管口的面积;
t为测试时间。
通过计算可得,水凝胶的透水率为180g>-1m-2。理想的伤口敷料的透水率范围为4至390g>-1m-2,因此,本实施例制备的水凝胶的透水率满足伤口敷料的使用要求。
3、蛋白质吸附
将已溶胀平衡的水凝胶放入96孔板中,设置三个平行样,每孔加入200μL含BSA的PBS溶液(浓度为0.5mg/mL),37℃条件下震荡24h后,将孔内液体吸出,并用PBS溶液冲洗样品3次以去除其表面物理吸附的蛋白质。使用BCA试剂盒定量分析所得溶液中的蛋白质浓度,使用酶标仪在562nm处读取光密度值,通过与标准曲线对照并计算得到水凝胶表面吸附蛋白质的含量,其结果如图8所示。
由图8可知,与商用水凝胶敷料(Hydrosorb)对比,本实施例制备的水凝胶吸附的BSA的量显著降低,表现出了更好的抗蛋白吸附的性能,有利于防止更换敷料时对新生组织产生的二次伤害。
4、抗细菌粘附性
将实施例2和对比例2所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图9所示。
由图9可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Ce3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
5、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例2和对比例2)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图10可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Ce3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力进一步提高。
6、细胞毒性
采用体外细胞实验测试水凝胶(实施例2和对比例2)的细胞毒性,具体过程为:
将小鼠成纤维细胞L929以5×104个/cm2的密度种植在24孔板上,培养24h。采用直接接触法和浸提液法测试水凝胶的细胞毒性,结果如图11所示,两种测试方法均表明,制备的水凝胶无细胞毒性。
7、Ce3+的释放
将实施例2和对比例2制备的水凝胶样品放置于清水中,释放的Ce3+含量通过电感耦合等离子体光谱仪测定。如图12上图所示,在水凝胶中加入rGO后,Ce3+的释放增加了233%。进一步,为了模拟实际情况,我们将制备的水凝胶放置在长满细菌生物膜的琼脂板上,测量水凝胶在接触细菌生物膜时的释放。如图12下图所示,在水凝胶中加入rGO后,Ce3+的释放增加了83%。这些结果显示,水凝胶中加入rGO能显著增加Ce3+的释放,提高水凝胶的抗菌性能。
实施例3
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.0g聚乙烯醇,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于50℃条件下搅拌12h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融4次,每次在-80℃条件下冷冻1h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入3mg/mL亚硫酸钠溶液中,室温反应10h,将GO还原为rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入0.5M的SmCl3溶液中,室温反应12h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡4h,制得水凝胶PVA-SA-rGO-Sm。
对比例3
对比例3与实施例3不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.0g聚乙烯醇,溶解于20mL水中,混匀,得PVA-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融4次,每次在-80℃条件下冷冻1h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入0.5M的SmCl3溶液中,室温反应24h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡4h,制得水凝胶得到PVA-SA-Sm。
对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、力学性能
采用Instron 4310万能材料测试系统表征水凝胶的力学性能,结果显示,水凝胶的杨氏模量为150kPa,断裂伸长率高达160%,显示了很好的柔韧性,可以经受使用敷料或更换敷料时产生的应力。
2、透水率
将一定尺寸的湿态水凝胶覆盖到含有一定PBS的离心管中,于37℃和湿度为60%的环境中放置24h,计算离心管中PBS蒸发的质量。
计算公式如下:
WVTR=(Wi-Wt)/A t
式中,Wi和Wt为离心管中初始和结束后PBS的质量;
A为离心管口的面积;
t为测试时间。
通过计算可得,水凝胶的透水率为110g>-1m-2。理想的伤口敷料的透水率范围为4至390g>-1m-2,因此,本实施例制备的水凝胶的透水率满足伤口敷料的使用要求。
3、蛋白质吸附
将已溶胀平衡的水凝胶放入96孔板中,设置三个平行样,每孔加入200μL含BSA的PBS溶液(浓度为0.5mg/mL),37℃条件下震荡24h后,将孔内液体吸出,并用PBS溶液冲洗样品3次以去除其表面物理吸附的蛋白质。使用BCA试剂盒定量分析所得溶液中的蛋白质浓度,使用酶标仪在562nm处读取光密度值,通过与标准曲线对照并计算得到水凝胶表面吸附蛋白质的含量,其结果如图13所示。
由图13可知,与商用水凝胶敷料(Hydrosorb)对比,本实施例制备的水凝胶吸附的BSA的量显著降低,表现出了更好的抗蛋白吸附的性能,有利于防止更换敷料时对新生组织产生的二次伤害。
4、抗细菌粘附性
将实施例3和对比例3所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图14所示。
由图14可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Sm3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
5、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例3和对比例3)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图15可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Sm3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力进一步提高。
6、细胞毒性
采用体外细胞实验测试水凝胶(实施例3和对比例3)的细胞毒性,具体过程为:
将小鼠成纤维细胞L929以5×104个/cm2的密度种植在24孔板上,培养24h。采用直接接触法和浸提液法测试水凝胶的细胞毒性,结果如图16所示,两种测试方法均表明,制备的水凝胶无细胞毒性。
实施例4
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于60℃条件下搅拌7h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应6h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融10次,每次在-20℃条件下冷冻1h,然后在室温下融化1h;
(4)将步骤(3)所得物浸入2mg/mL维生素C溶液中,室温反应24h,将GO还原为rGO,得到PVA-SA-rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入1.5M的LaCl3溶液中,室温反应24h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶PVA-SA-rGO-La。
对比例4
对比例4与实施例4不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL水中,混匀,得PVA-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应6h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融10次,每次在-20℃条件下冷冻1h,然后在室温下融化1h;
(4)将步骤(3)所得物浸入1.5M的LaCl3溶液中,室温反应24h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶得到PVA-SA-La。
对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、抗细菌粘附性
将实施例4和对比例4所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图17所示。
由图17可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入La3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
2、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例4和对比例4)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图18可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入La3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力提高一个数量级以上。
实施例5
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)取0.3g海藻酸钠和1.5g水溶性壳聚糖,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于80℃条件下搅拌7h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应16h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融4次,每次在-20℃条件下冷冻2h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入2mg/mL维生素C溶液中,室温反应24h,将GO还原为rGO,得到PVA-SA-rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入0.2M的GdCl3溶液中,室温反应24h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶PVA-SA-rGO-Gd。
对比例5
对比例5与实施例5不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和1.5g水溶性壳聚糖,溶解于20mL水中,混匀,得CS-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应16h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融4次,每次在-20℃条件下冷冻2h,然后在室温下融化2h;
(4)将步骤(3)所得物浸入0.2M的GdCl3溶液中,室温反应24h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶得到PVA-SA-Gd。
对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、抗细菌粘附性
将实施例5和对比例5所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图19所示。
由图19可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Gd3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
2、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例5和对比例5)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图20可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Gd3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力提高一个数量级以上。
实施例6
一种用于感染性慢性创面治疗的稀土掺杂水凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL浓度为1mg/mL的氧化石墨烯(GO)分散液中,于90℃条件下搅拌6h;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融两次,每次在-20℃条件下冷冻10h,然后在室温下融化3h;
(4)将步骤(3)所得物浸入2mg/mL维生素C溶液中,室温反应24h,将GO还原为rGO,得到PVA-SA-rGO;
(5)将步骤(4)所得物浸入0.2M的YbCl3溶液中,室温反应24h;
(6)使用无菌PBS溶液或水对步骤(5)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶PVA-SA-rGO-Yb。
对比例6
对比例6与实施例6不同之处是不加氧化石墨烯,具体过程如下:
(1)取0.3g海藻酸钠和2.7g聚乙烯醇,溶解于20mL水中,混匀,得PVA-SA;
(2)将步骤(1)所得物加入模具中,室温下静置反应12h,并去除体系中的气泡,制得预凝胶;
(3)将预凝胶反复冻融两次,每次在-20℃条件下冷冻10h,然后在室温下融化3h;
(4)将步骤(3)所得物浸入0.2M的YbCl3溶液中,室温反应24h;
(5)使用无菌PBS溶液或水对步骤(4)所得物反复浸泡2h,制得水凝胶得到PVA-SA-Yb。
对上述所得的水凝胶进行如下测试:
1、抗细菌粘附性
将实施例6和对比例6所得的水凝胶样品紫外消毒30min,每组设置三个平行样。将样品放入96孔板中,每孔加入200μL的菌液,并放入培养箱中培养24h。取出水凝胶,并用无菌PBS溶液冲洗3次以除去表面物理吸附的细菌,再将样品放入1mL无菌PBS溶液中超声震荡7min。取未稀释和分别用无菌PBS溶液稀释10倍和100倍后的菌液100μL涂抹于TSB琼脂培养板,37℃下培养14h,对菌落计数,用菌落形成单位(CFU)的数目来定量粘附在水凝胶上的细菌,其结果如图21所示。
由图21可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Yb3+都能显著降低水凝胶上粘附的细菌,而在加入rGO以后,水凝胶的抗细菌粘附性能进一步提高。
2、细菌生物膜的杀灭能力
将200μL细菌悬液(2×107CFU/mL)均匀涂敷在TSB琼脂板上,在37℃条件下隔夜培养,形成细菌生物膜。将消过毒的水凝胶(实施例6和对比例6)放置在形成的细菌生物膜上,37℃条件下培养24h。之后,将水凝胶和底下的琼脂取出,使用超声将细菌分散在PBS溶液中,采用涂板法计算细菌数目。
如图22可知,不论是对革兰氏阴性的绿脓杆菌,还是对革兰氏阳性的金色葡萄球菌,在水凝胶中加入Yb3+都能显著降低细菌生物膜中的细菌数目,而在加入rGO以后,水凝胶对细菌生物膜的清除能力提高一个数量级以上。
机译: ws7622a包含预防性/治疗性组合物,用于预防和治疗弥散性血管内凝血,慢性感染性呼吸系统疾病或慢性支气管炎
机译: 包含WS7622A的预防/治疗组合物,用于预防或治疗弥散性血管内凝血,慢性呼吸道感染性疾病或慢性支气管炎
机译: WS7622A包含预防性和治疗性组成成分,用于预防和治疗分布物,血管内凝结,慢性,感染性呼吸系统疾病或慢性支气管炎