Molekularbiologische Untersuchungen zu Funktion und Phylogenie methanotropher Bakterien

摘要

Die hier beschriebenen Studien dienten der Charakterisierung von methanotrophen Bakterien (MB) mittels molekular- und mikrobiologischer Techniken sowie mittels Methoden der angewandten Bioinformatik. Die Anwendung dieses Methoden-Bestecks auf verschiedene konkrete Fragestellungen schlägt sich im kumulativen Charakter dieser Arbeit nieder. Vorgestellt werden Arbeiten zu folgenden, voneinander abgegrenzt dargestellten Themen: i) Untersuchung der Verbreitung der pMMO-2, einer neuartigen paralogen Kopie der partikulären Methan-Monooxygenase (pMMO-1), eines Schlüsselenzyms der MB sowie die vergleichende Analyse der Operonstrukturen der für pMMO-1 bzw. pMMO-2 kodierenden Gene, ii) Charakterisierung der potenziell zu Methan hoch-affinen MB des "Upland Soil Cluster a" (USC a) mit Methoden der Metagenomik, iii) vergleichende Analyse der für Enzyme der N2-Fixierung kodierenden Gene nifH und nifD methanotropher Bakterien sowie iv) Entwicklung eines Computerprogramms für in silico tRFLP-Analysen sowie dessen Erprobung im Rahmen der populationsökologischen Charakterisierung einer MB-Population. i) Die kultivierten MB wurden aufgrund phylogenetischer, morphologischer und physiologischer Eigenschaften in Typ I, Typ II und Typ X MB eingeteilt. Anhand des für eine Untereinheit der pMMO-2 kodierenden pmoA2-Gens konnte die weite Verbreitung dieses bislang uncharakterisierten Enzyms innerhalb der Typ II MB dargestellt werden. Auffällig ist, daß manche MB pmoA2 nicht enthalten, obwohl das Gen für phylogenetisch wie physiologisch nah verwandte Organismen nachgewiesen wurde. pmoA2 wurde in keinem der untersuchten Typ I MB oder Typ X gefunden. Die Erstellung einer BAC-Bibliothek erlaubte die vergleichende Sequenzanalyse der für pMMO-1 bzw. pMMO-2 kodierenden Gene des Referenz-Organismus Methylocystis sp. Stamm SC2. Beide Operons bestehen aus drei Genen, die in der Reihenfolge pmoCAB organisiert sind. Im Zuge dieser Arbeit wurde die Anzahl bekannter pmo-Operons mehr als verdoppelt (vgl. Punkt ii). Die zuvor für Typ II und Typ X MB bekannte Gen-Anordnung ist somit bei allen bisher untersuchten MB hochkonserviert. Trotz deutlicher Sequenz-Unterschiede der kodierenden Gene ähnelt pMMO-2 sowohl hinsichtlich der Operon-Struktur als auch der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz stark der pMMO-1. Vergleichende Analysen der abgeleiteten Sekundärstrukturen sowie hochkonservierter Aminosäuren führten dazu, daß der pMMO-2 die Funktion einer Methan-Monooxygenase zugeordnet werden konnte. Mittels der 5'-RACE-Technik wurde die Transkription der pMMO-2 nachgewiesen und die Promotoren beider Operons identifiziert. ii) Obwohl die biogene Oxidation atmosphärischen Methans nachgewiesen ist, wurden bis heute keine MB isoliert, die eine entsprechend hohe Affinität zu Methan aufweisen und die zu Wachstum unter atmosphärischen Methan-Konzentrationen befähigt sind. Die methanotrophe Population von als biogene Methan-Senken charakterisierten, aciden "Upland"-Böden wird durch Vertreter des USCa dominiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals ein größeres genomisches Fragment eines Repräsentanten dieser bislang nicht kultivierten MB vergleichend analysiert. Dazu wurden die Methoden der Metagenomik etabliert und eine ca. 250.000 Klone umfassende Fosmid-Bibliothek aus Waldboden-DNA erzeugt. Mittels PCR-basierten Hochdurchsatz-Screenings konnten zwei Klone mit USCa-spezifischen Inserts identifiziert werden. Dabei diente der zentrale Bereich der pmoA als Markergen. In phylogenetischen Verrechnungen gruppieren partielle pmoA-Sequenzen des USCa gemeinsam mit dem pmoA-Gen des einzigen kultivierten Vertreters der Gattung Methylocapsa, M. acidiphila. Deshalb wurde eine Genom-Bibliothek von M. acidiphila konstruiert und ein 100 kb großes Fragment zu Referenzzwecken sequenziert. Die vergleichende Analyse der erzielten Sequenzen gegen ca. 200 vollständig sequenzierte prokaryotische Genome bestätigte die nahe Verwandschaft von USCa und M. acidiphila und ermöglichte die eindeutige Zuordnung der Mitglieder des USCa zu den Alphaproteobacteria. Die Analyse der für die pMMO kodierenden Gene ergab für beide Genom-Fragmente die Anordnung in einem Operon in der Reihenfolge pmoCAB. Die vergleichende Analyse der Primär- und Sekundärstruktur der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen ergab keine Hinweise auf eine erhöhte Affinität der pMMO des USCa zu Methan, sondern hohe Übereinstimmungen mit den abgeleiteten Strukturen anderer pMMOs. Allerdings konnte stromabwärts des pmo-Operons ein Gen identifiziert werden, das sowohl bei M. trichosporium Stamm OB3b als auch bei den homologen AMO-Operons nitrifizierender Bakterien an gleicher Stelle lokalisiert ist und möglicherweise ein viertes Gen des pmo-Operons darstellt.