Studio dei meccanismi di morte dopo somministrazione di catechine estratte dal tè verde in cellule epiteliali prostatiche immortalizzate e tumorigeniche.

摘要

L’infuso di foglie di tè verde (C. sinensis) è una bevanda estremamente popolare in tutto il mondo il cui consumo abituale, secondo solo a quello dell’acqua, è da tempo stato associato a benefici per la salute. Tra questi, oltre ad esiti positivi sul diabete, obesità e malattia neurologiche, quello più rilevante è l’effetto chemiopreventivo in un ampio ambito di patologie tumorali. A tal proposito è da tempo stabilito come, gran parte degli effetti benefici generali e di possibile chemioprevenzione del cancro da parte del tè verde, siano mediate da alcuni dei suoi componenti, i polifenoli e, soprattutto la -(-)epigallocatechin-3-gallato (EGCG), la catechina più abbondante in assoluto (50-80% del peso secco di una foglia; 200-300 mg in una tazza di tè verde).L’attività chemiopreventiva dell’EGCG è supportata da osservazioni epidemiologiche, studi su colture cellulari, su modelli animali e sull’uomo. Recenti studi clinici di fase I e II sono stati condotti per esplorare gli effetti chemiopreventivi dell’EGCG negli esseri umani rivelando come il trattamento con EGCG inibisce, con varie modalità ed in organi diversi (quali fegato, pomone, stomaco, seno, prostata e colon), la proliferazione e la trasformazione di cellule pre-neoplastiche e neoplastiche come pure la neoangiogenesi, l’invasione del tumore e la formazione di metastasi in organi diversi come fegato, stomaco, polmone, seno, prostata e colon.Numerodi studi in vitro hanno evidenziato come l’EGCG induca l’arresto della crescita, alterando l’espressione di proteine che regolano il ciclo cellulare e sopprimendo l’espressione di alcuni oncogeni. Provoca inoltre morte cellulare modificando il rapporto delle proteine Bcl2/Bax in maniera da favorire l’apoptosi. Il blocco della proliferazione e l’induzione di morte cellulare sono indipendenti dallo stato della proteina p53 ma, in generale, è possibile affermare che, cellule aventi una p53 funzionante rispondono a dosi inferiori di EGCG. È stato suggerito che i polifenoli estratti dal tè verde siano in grado di inibire il processo di carcinogenesi, modulando una vasta gamma di vie di trasduzione del segnale coinvolte nello sviluppo del cancro, quali Jak/STAT, MAPK, PI(3)K/Akt, Wnt, Notch. È stato anche proposto che, almeno in vitro, le catechine estratte dal tè verde siano inibitori dell’attività del proteasoma e che, quindi, interferiscano con le vie di degradazione delle proteine ubiquitina-dipendenti.É interessante notare come gli effetti antiproliferativi e pro-apoptotici delle catechine del tè verde siano specifici per le cellule trasformate, mentre non si riscontrino effetti tossici su colture primarie di cellule normali. Risultati ottenuti in studi precedentemente pubblicati dal nostro gruppo di ricerca e da altri autori, hanno confermato che l’EGCG risulta efficace nell’inibire la proliferazione sia di cellule epiteliali prostatiche immortalizzate non tumorigeniche (PNT1a), sia di cellule pienamente trasformate, metastatiche, androgeno indipendenti e tumorigeniche, quali le PC-3, risultando invece inefficace in cellule epiteliali prostatiche normali in coltura primaria.Questo risultato è particolarmente importante, in quanto evidenzia che l’effetto citotossico e citostatico delle catechine del tè verde è specifico per le cellule trasformate.I dati raccolti hanno confermato come la somministrazione di Polyphenon E® (Poly-E) risulti citotossica per entrambe le linee cellulari, PNT1a e PC-3, sebbene le concentrazioni di inibizione della proliferazione (IC50), siano diverse nelle due linee (rispettivamente 35 µg/mL e 145 µg/mL). Inoltre, abbiamo verificato che le due linee cellulari rispondono al trattamento con Poly-E attivando percorsi molecolari diversificati, nei modi e nei tempi di attuazione, che portano in ogni caso all’inesco di un meccanismo di morte programmata. Le PNT1a reagiscono al trattamento con Poly-E attraverso meccanismi inzialmente citoprotettivi. L’innesco del processo autofagico, che abbiamo verificato fra le 6 e le 12 ore di trattamento, è da considerarsi un evento marginale e transitorio, con funzioni pro-sopravvivenza. Esso risulta anche causa di una concomitante e transitoria attivazione di meccanismi associati a stress del reticolo endoplasmatico (ERS), che tendono ad autolimitarsi dopo le 12 ore. Dalle 24 ore in avanti, gli inziali percorsi di sopravvivenza messi in atto da queste cellule lasciano il posto all’attivazione di un programma di apoptosi intrinseca che coinvolge sia le propteine BH3-only (membri pro-apoptotici della famigglia Bcl-2) che il clivaggio delel caspasi -9, -7 e -3. Il tutto si conclude con l’attivazione della PARP e la frammentazione del DNA, mentre, in concomitanza, le cellule perdono il contatto con la superficie di crescita e se ne distaccano (morte per anoikis).Le cellule PC-3 sono più resistenti delle PNT1a al trattamento con le catechine, e richiedono concentrazioni più elevate di Poly-E (145 µg/mL) per andare incontro prima al blocco della proliferazione e poi a morte. Il processo morfologico più evidente nelle cellule PC-3 dopo la somministrazione di Poly-E è una massiccia vacuolizzazione citoplasmatica che porta a stravolgere l’aspetto della cellula la quale rimane comunque aderente al substrato di crescita fino alla morte. Le indagini da noi svolte hanno permesso di appurare come, in queste cellule, il Poly-E induca un marcato e persistente ERS, che si concretizza nell’induzione del fattore di trascrizione ATF4 e, di conseguenza, nell’aumento della trascrizione di eIF2α (poi fosforilata), GADD34 e CHOP, noti marcatori di stress del reticolo. L’aumento dell’espressione di questi geni è stato anche verificato a livello di proteina. p38 MAPK è un membro della famiglia di MAP chinasi attivato tramite fosforilazione in risposta a varie tipologie di stress. Mentre il percorso di ERK (MAPK attivate da segnali extracellulari) regola principalmente un programma di proliferazione e sopravvivenza, la via di segnalazione che coinvolge JNK è in grado di promuovere sia la proliferazione che l’apoptosi. È già noto in letteratura come la via di p38 MAPK, può essere implicata nella soppressione della tumorigenesi, poichè inibisce la proliferazione cellulare attraverso una riduzione dell’espressione della ciclina D1 e il coinvolgimento di geni oncosoppressori quali p16/Rb e p19ARF/p53. Mentre in cellule PNT1a il ruolo di p38 MAPK, sulla base delle indagini dai condotte, non appare definibile con chiarezza, nelle cellule PC-3 abbiamo verificato una marcata attivazione di p38α dopo 24 ore di trattamento con Poly-E, che si mantiene fino a 48 ore. L’aumento della fosforilazione di p38α, nelle cellule PC-3, correla con l’aumento dell’espressione di proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2, come PUMA e Bax, coinvolte nell’attivazione della via di morte che culmina con l’aumento della permeabilizzazione della membrana mitocondriale ed il rilascio di AIF. Non possiamo inoltre escludere che, sempre p38α, sia coinvolto nell’attivazione di CHOP di concerto con ATF4, e contribuisca a mantenere elevati i valori di questo marcatore di ERS.In conclusione, i nostri dati evidenziamo come il reticolo endoplasmatico rappresenti un bersaglio cellulare particolarmente importante nel meccanismo di azione antiproliferativo e pro-apoptotico delle catechine del tè verde. Ulteriori approfondimenti saranno necessari per delucidare, in termini meccanicistici, quali molecole intervengano fra l’induzione dell’ERS, l’UPR e l’attivazione di meccanismi effettori di morte cellulare.Gli estratti standardizzati di catechine del tè verde si propongono come agenti naturali nella prevenzione del cancro per la loro assenza di tossicità sicurezza, i bassi costi e la biodisponibilità. Pertanto potrebbero risultare utili ulteriori approfondimenti sulla valutazione dell’utilizzo delle catechine da sole o in combinazione con terapie convenzionali per la prevenzione della progressione progressione tumorale e/o il trattamento delle neoplasie umane.