Impact of integrase polymorphisms and minor quasispecies in HIV-1 infected individuals naive or treated with strand-transfer integrase inhibitors: a refined analysis by cloning and 454-pyrosequencing techniques

摘要

Introduzione: Raltegravir è un potente ed efficace inibitore dell’ integrasi (IN) di HIV-1, recentemente approvato dall’FDA anche nei regimi HAART di prima linea. Dagli studi attualmente disponibili in letteratura, il ruolo dei polimorfismi naturali e delle quasi specie minoritarie dell’integrasi sul responso virologico agli InSti e sullo sviluppo di resistenza durante il fallimento è ancora poco chiaro. Pertanto questo lavoro mira a verificare la presenza di mutazioni di resistenza agli InSti nelle quasispecie naturali di HIV-1 in pazienti naive a tali inibitori e a valutare l’impatto sulla suscettibilità fenotipica in vitro, sulla capacità replicativa virale e sul responso virologico a raltegravir utilizzando tre diversi approcci: il metodo clonale, il sequenziamento di popolazione e il pirosequenziamento massivo 454 (Ultra-deep 454 Pyrosequencing [UDPS]). udMetodi: Per l’approccio clonale, le sequenze di RT-RNAse H-IN sono state amplificate tramite PCR da campioni di plasma da 49 individui infetti da HIV-1 sottotipo B (21 naive al trattamento e 28 in fallimento a regimi antiretrovirali non includenti gli InSti) e ricombinate con un vettore di espressione contenente lo stipite di HIV-1 HXB2D deleto della regione RT-IN. I virus ricombinanti ottenuti sono stati testati per la suscettibilità a raltegravir ed elvitegravir e per la capacità replicativa. Da 49 pazienti sono stati ottenuti 344 cloni ricombinanti testati genotipicamente e fenotipicamente in vitro. udPer l’analisi con il sequenziamento di popolazione, sono stati analizzati 206 pazienti multi-trattati, provenienti da 8 diversi centri clinici italiani e francesi, che iniziavano il trattamento con un regime contenente raltegravir. Il genotipo dell’IN e la viremia sono stati effettuati prima e durate l’inizio della terapia. Alla 24esima settimana di trattamento erano disponibili valori di viremia per 177 pazienti. La prevalenza delle mutazioni è stata calcolata nella popolazione totale, nei pazienti che hanno raggiunto il successo virologico e nei i pazienti che hanno fallito alla 24esima settimana di trattamento. Per i polimorfismi con una prevalenza maggiore del 5% è stato anche considerato l’uso specifico dei codoni codificanti le mutazioni. Per valutare se i polimorfismi ed altre variabili (la viremia, i farmaci co-somministrati e il sottotipo) fossero predittori indipendenti di successo virologico, è stata effettuata un’analisi di regressione logistica (uni e multivariata). udPer l’analisi con l’UDPS un sottogruppo di 27 pazienti trattati con raltegravir è stato genotipizzato al baseline e al fallimento. Inoltre è stato effettuato il test fenotipico delle popolazioni virali al fallimento. udPer tutti e tre gli approcci sono state analizzate tutte le mutazioni dell’ integrasi con particore attenzione alle mutazioni di resistanza note. In particolare per l’UDPS, il rilevamento delle mutazioni è stato considerato attendibile osservando una prevalenza >0.1%(>50 varianti). udRisultati: Dall’approcio clonale, la maggior parte dei cloni testati non ha mostrato resistenza fenotipica agli InSti: 0/344 cloni hanno mostrato resistenza per raltegravir e solo 3 cloni (0.87%) hanno mostrato bassi livelli di resistenza per elvitegravir. Non è stata osservata alcuna mutazione di resistenza primaria per raltegravir e/o elvitegravir. Nei cloni resistenti a elvitegravir sono state trovate alcune mutazioni secondarie, come la T97A e la G140S. Inoltre è stata osservata una nuova mutazione, E92G, anch’essa in quasispecie minoritaria, associata a resistenza fenotipica a elvitegravir. udTra i 206 pazienti analizzati con l’approccio di sequenziamento di popolazione, 186 (90.3%) sono risultati infetti da sottotipo B mentre 20 (9.8%) sono risultati infetti da sottotipi non B (4A, 1C, 2D, 5F, 2G, 5CRF_02AG, 1CRF_12BF2). Alla 24esima settimana di trattamento con raltegravir il 70% dei pazienti ha raggiunto il successo virologico (il 71.3% [114/160] e il 58.8% [10/17] infetti da virus di sottotipo B e non-B rispettivamente, p=NS). Al basale non è stata trovata alcuna mutazione di resistenza primaria mentre le secondarie (L74M, T97A, G140A, V151I, N155S, G163R) hanno mostrato una bassa frequenza (≤1%). La presenza al basale di tali mutazioni secondarie, come di altri polimorfismi (con l’eccezione della T125A, codone GCA, “vedi sotto”) non hanno influenzato statisticamente il responso virologico dei pazienti che hanno iniziato raltegravir (Fisher test, correzione di Benjamini-Hockberg). Dall’analisi di regressione logistica multivariata, i predittori indipendenti di negativo responso virologico erano: la viremia al basale (OR=0.42 [CI:0.3-0.7], p=0.0003), la co-somministrazione di AZT or D4T (OR=0.31 [CI:0.1-0.9], p=0.04) e la presenza al basale del polimorfismo T125A (specifico codone GCA, che è sequenza di riferimento per i sottotipi A, C, D, G and for CRF02_AG) (OR=0.30 [CI: 0.1-0.7], p=0.006). La prevalenza di questa mutazione, T125A(specifico codone GCA) risulta più alta nei pazienti infetti da sottotipi non-B (13/20 [65%]) vs B subtype (35/186 [19%]) (OR=0.12 [CI:0.05-0.33], P=0.00003) con una maggiore discrepanza tra i pazienti in fallimento ( 6/7 [86%] non-B subtype vs 14/46 [30%] B subtype, OR=0.07 [CI:0.01-0.52],p=0.009). udDall’approccio UDPS, al baseline, tra più di 200000 sequenze dell’IN analizzate, non è stata trovata alcuna variante minoritaria con resistenza primaria a raltegravir con una frequenza > 0.1%. Le mutazioni secondarie T97A, F121Y e V151I sono state trovate raramente e indifferentemente in pazienti in successo e/o in fallimento, con una frequenza compresa tra lo 0.3-99% delle specie virali. Indipendentemente dal metodo di sequenziamento utilizzato, la presenza di varianti resistenti secondarie al basale non correlava al fallimento, né con l’evoluzione alla stessa posizione amminoacidica, né con lo sviluppo di mutazioni primarie. Al basale non è stata osservata resistenza fenotipica a raltegravir, tuttavia al fallimento, i pazienti che hanno sviluppato le mutazioni primarie N155H, Q148H/R o Y143R, associate ad altre mutazioni secondarie (L74M, T97A, E92Q, G140S, V151I, E157Q, G163R, S230R) o non note (E92A, T112A) hanno mostrato un ridotta suscettibilita a raltegravir (Fold change >30-100). Di particolare interesse, in 1 paziente in fallimento, è stata trovata la combinazione delle mutazioni primarie N155H e Y143C, sia utilizzando il sequenziamento di popolazione sia l’UDPS. Queste mutazioni, apparse al fallimento nell’80% degli aplotipi del paziente, sono associate ad alta resistenza fenotipica particolarmente spiccata per raltegravir (FC raltegravir = 1255.3; FC elvitegravir = 625.3). udConclusioni: Dai saggi fenotipici e di genotipizzazione classici e ultra sensibili, la resistenza pre-esistente a raltegravir nei pazienti naive agli InSti è un evento raro e quando presente risulta confinato soltanto in quasi specie minoritarie secondarie. Al basale, solo la presenza della mutazione T125A(GCA), più prevalente nei sottotipi non-B, è risultata associata a un inferiore responso virologico a raltegravir. Questa osservazione nei sottotipi non-B è intrigante e necessita di ulteriori investigazioni. L’impatto clinico e la rilevanza di questo polimorfismo devono comunque ancora essere determinati. udIn conclusione, questo studio suggerisce che, allo stato attuale, effettuare il genotipo dell’integrasi in tutti i pazienti prima dell’inizio di raltegravir, potrebbe avere un rapporto costo-beneficio spostato verso il costo e non dovrebbe essere raccomandato, almeno fino a quando non si abbiano evidenze di resistenza trasmessa agli InSti o sia chiarita la rilevanza clinica dei polimorfismi e quasispecie minoritarie naturali.