Cryoconservation d'une lignée cellulaire sécrétrice d'insuline, les INS 832/13, à l'aide d'une formulation à base de protéines de blé

摘要

Le diabète de type I est une maladie auto-immune pouvant s'avérer incontrôlable chez certains patients. L'injection quotidienne d'insuline devient dès lors insuffisante et de nombreux effets adverses peuvent être observés. Dans de tels cas, deux options se présentent aux praticiens, la transplantation d'un pancréas ou la transplantation d'îlots de Langerhans. La première option, réservée à des cas spécifiques qui nécessitent une double greffe (généralement pancréas et rein), consiste en un acte chirurgical invasif et lourd et elle est limitée par la disponibilité de pancréas. La deuxième option, moins invasive, est limitée par la quantité d'îlots fonctionnels et de qualité. Elle requiert plus d'un donneur. L'une des solutions à ce problème est l'amélioration des protocoles de cryoconservation des îlots de Langerhans. Les techniques actuelles ont surtout recours au diméthylsulfoxyde (DMSO), lequel est toxique pour les îlots. D'où l'intérêt de développer de nouvelles méthodes de cryoconservation plus efficaces et moins toxiques. Nous suggérons une nouvelle approche de cryoconservation faisant appel à des protéines végétales et des protéines recombinantes issues du blé. Des cultures primaires d'hépatocytes ont déjà été efficacement cryoconservées avec cette méthode. Une forte viabilité, une bonne adhésion et le maintien des fonctions hépatospécifiques telles que la sécrétion d'albumine et l'induction des isoenzymes de cytochrome P450 furent alors observés. L'hypothèse était que cet extrait de protéines du blé (WPE) et un mélange de protéines recombinantes allaient avoir le potentiel d'améliorer la viabilité de cellules pancréatiques de même que leurs fonctions biologiques après cryoconservation. Le potentiel de ces extraits est lié au mélange de protéines qui ont des fonctions différentes mais complémentaires. La lignée cellulaire INS832/13 provenant d'un insulinome pancréatique de rat induit par rayon X capable de mimer le comportement des cellules et de sécréter de l'insuline a été utilisée pour les premiers essais. Les objectifs principaux étaient le développement d'un milieu de cryoconservation adapté aux particularités de cette lignée avec détermination de la dose optimale de protéines de blé et l'étude de la viabilité des cellules et de leurs fonctions biologiques post-décongélation. Une lignée cellulaire ne réagissant pas comme une culture primaire, nous avons dû procéder à de nombreux ajustements afin de développer un milieu de cryoconservation capable d'avoir une toxicité réduite, de conserver une survie maximale des cellules post-décongélation mais aussi une adhérence suffisante pour permettre le retour des principales fonctions biologiques associées au métabolisme pancréatique telles que la sécrétion d'insuline et de C-peptide. Plusieurs mélanges ont été testés et optimisés car l'extrait de blé seul, bien que non toxique pour les cellules, ne permettait pas une adhésion suffisante des cellules post-décongélation, laquelle est capitale pour le maintien des fonctions biologiques. Le protocole optimisé consiste en une étape de pré-incubation de 7,5 x 105 cellules soit avec un mélange de lécithine/glycérol N-méthyl pyrrolidone (NMP) 1% ou un mélange lécithine/glycérine pendant une heure à 37°C suivi de l'addition de 5 mg de WPE et une cryoconservation immédiate. Nos résultats démontrent que l'ajout de protéines de blé dans le milieu permet de cryoconserver avec efficacité les cellules INS832/13. Ces protéines de blé sont non toxiques, n'ont aucun effet adverse sur la sécrétion d'insuline et permettent une bonne viabilité post-décongélation. La pré-incubation avec des lipides prévient l'adhésion des protéines de blé à la membrane des cellules et améliore également la viabilité et l'adhésion post-décongélation des cellules INS832/13. Les fonctions métaboliques sont maintenues chez les cellules INS832/13 cryoconservées avec le mélange optimisé et l'expression des gènes clé associés au métabolisme pancréatique est comparable entre les cellules fraîches et celles cryoconservées avec notre formulation. La lécithine semble protéger la membrane cytoplasmique contre les dommages induits pendant la cryoconservation tandis que les protéines de blé semblent, quant à elles, améliorer le métabolisme, notamment par une augmentation de la capacité insulino-sécrétoire induite par le glucose. Notre mélange optimisé représente donc une alternative intéressante à la cryoconservation au DMSO et il serait pertinent de tester et d'adapter ce mélange sur des îlots de Langerhans.ud______________________________________________________________________________ udMOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cryoconservation, protéines de blé, cellules pancréatiques bêta, viabilité, métabolisme, sécrétion d'insuline