РОЛЬ ШАПЕРОНОВ Hsp70 (DeaK-DnaJ-GrpE) и Hsp100 (ClpA и ClpB) В РЕФОЛДИНГЕ И ПОВЫШЕННОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛЮЦЙФЕРАЗ В КЛЕТКАХ Escherichia coli

摘要

Исследуется роль шаперонов Hsp70 (DnaK- DnaJ-GrpE) и Hsp100 (ClpA-ClpB -ClpX) в рефолдинге термо-инактивированных люцифераз из морских бактерий Photobacterium fischeriи наземных бактерий Photorhabdus luminescens. Эти люциферазы гомологичны, однако значительно различаются по скорости термоинактивации и по константе скорости люминесцентной реакции. Показано, что рефоддинг термоинактивированных люцифераз полностью определяется системой DnaK— DnaJ-GrpE. Однако по скорости и уровню рефолдин-га эти люциферазы заметно различаются. Если термолабильная, быстрая, люцифераза Ph. fischert в процессе рефолдинга восстанавливает активность до 80% от исходного уровня за несколько минут, то термрста-бильная, медленная, люцифераза Ph. luminescens ренагурирует значительно медленнее (десятки минут) и достигает всего лишь ～ 7—8% от исходного уровня. Измерение скорости термоинактиваций люцифераз in vivo в клетках Escherichia coli дикого типа и мутантных по генам clpA, clpB, clpX показало, что люцифераза Ph. luminescens проявляет пониженную термоустойчивость в мутантном штамме Е. coli clpA-. Показано, что этот эффект не связан с DnaK-зависимым рефолдингом. Для термолабильной люциферазы Рh. fischeri влияние мутации в гене clpA на ход кривой гермоинактивации практически отсутствует. Предполагается, что денатурированная люцифераза Ph. luminescens имеет повышенное сродство к белку-шаперону ClpA по сравнению с DnaK, в то время как гермолабильная люцифераза Ph. flscheri, напротив, имеет повышенное сродство к шаперону DnaK. Связывание денатурированной люциферазы с ClpA защищает ее от агрегации, а последующий рефоддинг; по-видимому, происходит спонтанно и очень быстро (в пределах 1-2 мин). Данный процесс относится к разряду АТР-зависимых, так как введение в бактериальные клетки разобщителя окислительного фосфорилирования карбонил-цианид-3-хлорофенилгидразона приводит к резкому снижению термосгабильносш люциферазы до уровня, характерного для фермента in vitro. В бактериях Е. соli, мутантных по гену clpB, также наблюдается повышенная гермочувствительность люцифераз, однако этот эффект определяется DnaK-зависимым рефолдингом и имеет место для обеих люцифераз Ph. flscheri и Ph. luminescens и, по-видимому, связан со способностью шаперона ClpB проводить дезагрегацию белков, подготавливая их к взаимодействию с шаперонами семейства Hsp70 (DnaK—DnaJ—GrpE).