ピキア酵母を宿主とするヒト組換えタンパク質の分泌発現 -小型培養槽を使用したミッドカイン，プレイオトロフィン， および胆汁酸活性化リパーゼの小規模生産一

摘要

メタノール資化性酵母，ピキア酵母、Pichiapastoris) の異種タンパク質発現系は，現在ではいろいろなタンパク質の発現に広く使用されている.目的タンパク質を分 泌することができる組換えピキア酵母細胞の高密度培養 により，大量の目的タンパク質の，培地中への効率的な発現を達成できる可能性がある.筆者らは，このシステ ムを用いて，組換えピキア酵母の高密度培養により，3 種のヒトタンパク質，サイト力イン（または成長因子） であるミツドカインとプレイオト口フィン，および母乳 胆汁酸活性化リパーゼの発現を試みた.ミッドカインの発現では，それ自身の分泌シグナルを 使用したとき，分泌したミツドカインの約半分は酵母に 特有なマンノシル化を受けていた.そこで次に，alpha-接 合因子の分泌シグナルを使用した.このとき，培地中に 分泌したミッドガインはマンノシル化を受けておらず， 発現量は約640mg/lであった.しかし，発現物の約70% は，ァミノ末端からいくつかのアミノ酸が欠失していた. この結果から次に，プロテアーゼA欠損株を宿主として使用し，発現を，20°C， pH 3の条件で行った.1週間 のメタノールによる誘導終了後，修飾されていない真正 ミツドカイン約360 mg/lが得られた.プレイオトロフィ ンの発現は，alpha-接合因子の分泌シグナル，および宿主 としてGS115を使用して組換え体を作製し，ミツドカ インの最終培養条件で発現培養を行った.ただし，発現 は，pH5で行った.メタノールによる発現誘導4日間で， 約260 mg〃の修飾されていない真正プレイオトロフィ ンが得られた.拡張吸着流動床ストリームラインの使用 によって，培養液中のプレイオト口フィンを96%の収 率で回収した.胆汁酸活性化リパーゼの発現では，パン酵母のィンべ ルターゼ分泌シグナルを使用した.小型培養槽を用いた 発現培養においては，胆汁酸活性化リパーゼの発現が， 低い細胞密度でメタノールによって誘導されたとき，発 現産物はほとんど培地中に蓄積しなかった.そこで，メ タノールによる誘導の時期や酵母細胞増殖期の培養条件 を種々検討し，これらを最適化した.最終的には約 1000 mg〃の胆汁酸活性化リパーゼを，培地中に蓄積さ せられるようになった.ピキア酵母異種タンパク質発現系は，既に特定のタン パク質医薬品の生産のための強力な手段となっている. 上記のように，3種のヒトタンパク質について，多くの 試行錯誤の結果，適切な組換え体作製，および適切な条 件下で，それらの高密度発現培養を行い，結果として大 量のヒト組換えタンパク質が得られた.組換えタンパク 質を工業的に生産するためには，適切な組換え体の作製， および発現培養条件の最適化が必須であり，しかもこれ らは時間のかかる研究である.ここで記述されたこれら の過程は，他のタンパク質の発現培養のためにも役に立 つだろう.