内皮细胞在涂层心血管植入物表面的生长:模似仿生性构建具有生物活性的细胞外基质

摘要

冠状动脉内置入药物涂层支架显著解决了支架内再狭窄,但是,支架内晚期及超晚期血栓带来新的难题加快支架内皮化,预防血栓形成成为研究的关键.目的:观察内皮细胞在经刻蚀并构建仿生的生物活性表面,整合细胞外基质成分的金属钛表面的生长情况.设计、时间及地点:对比观察,于2007-08/2009-01在西南交通大学先进材料与技术教育部重点实验室完成.材料:成年杂交犬6只,体质量15-20kg,纯钛(99.997%)为西安宝鸡有色金属有限公司产品,切割成5mmx5mmx2mm圆片试样.方法:在已刻蚀的认表面通过自组装技术构建胶原-肝素-血管内皮生长因子一内皮祖细胞膜蛋白抗体为组分的多层膜作为涂层组:未涂层的钛为未涂层组.成年杂交犬6只,涂层组样品置入右侧股动脉,未涂层组置入左侧股动脉内,获得2h,15d,3个月的样品.主要观察指标:乳酸脱氢酶实验测定黏附血小板的数量:酶联免疫法测定GMP-140以检测黏附血小板激活程度;扫描电镜观察黏附血小板的形貌;采用Sysmex CA-600凝血仪测定活化部分凝血活酶时间及凝血酶原时间.扫描电镜观察植入物在不同时间点,内皮细胞在其表面的生长;免疫荧光法观察置入2h的试片表面分化成熟的内皮细胞,其血管内皮生长因子受体2的表达.结果:①乳酸脱氢酶实验显示涂层样片的乳酸脱氢酶值比未涂层显著减少,说明涂层钛可以减少血小板的黏附(P＜0.05).②附血小板激活程度的定量分析结果显示在涂层上黏附血小板P-选择素的表达显著小于未涂层上的表达(P<0.05).③扫描电镜可见涂层钛表面黏附血小板形貌的变形程度小于未涂层钛.④涂层的活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间分别是(134.2±13.3),(34.2±5.7)s;未涂层的活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间分别是(44.9±2.3),(17.3±2.4)s,可见涂层的凝血时间显著延长(P<0.05).⑤扫描电镜可见置入2h:对照样品被血凝块覆盖;涂层样品表面血凝块少而局限.置入15d:对照组大最纤维状物质沉积涂层样品表面均匀覆盖一层长梭形细胞.置入3个月:对照组表面增生特别明显,沿血流方向排列:实验组表面覆盖组织显示更加成熟,均匀覆盖一层细胞,细胞的形态也更加接近血管内膜的内皮细胞.⑥免疫荧光可见涂层样品表面黏附大量的血管内皮生长因子受体2阳性细胞,而对照组血管内皮生长因子受体2阳性细胞较少.结论:内皮细胞在仿生性的具有生物活性的细胞外基质中能迅速被捕获固定,内皮细胞生长必须以抗凝为前提.对于促进内皮细胞的生长和分化构建有生物活性的仿生底物是途径之一.