Isolamento, cultura, caracteriza??o e criopreserva??o de células tronco derivadas de camada amniótica mesenquimal e de tecido do cord?o umbilical de fetuses bovinos

摘要

RESUMO: As células tronco mesenquimais (CTMs) est?o presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplica??o. Quando cultivadas in vitro s?o capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. As células tronco mais utilizadas, tanto na medicina humana como na medicina veterinária s?o as células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo. Atualmente, uma grande tendência para a utiliza??o de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cord?o umbilical (TCU) e sangue do cord?o umbilical (SCU) pode ser observada, já que estas fontes podem ser colhidas no momento do parto por uma técnica n?o invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA e TCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e de fetos do ter?o inicial da gesta??o em abatedouro-frigorífico. As células foram recuperadas por meio de digest?o enzimática tecidual, realizada com solu??o de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e TCU no momento do parto (n=6) e de MA e TCU no ter?o inicial de gesta??o (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológicas, imunofenotípica por imunocitoquímica e citometria de fluxo, diferencia??es in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e ainda, avalia??o da viabilidade após a criopreserva??o por citometria de fluxo. Todas as amostras dos diferentes grupos demonstraram ades?o ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marca??o para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marca??o para CD44, ausência de marca??o para ou baixíssima express?o de CD34 (MA: TI-0,3%a, PA-3.4%b; TCU: TI-0,4%, PA-1.4%) e nula ou baixa express?o de MHC II (MA: TI-1.5%a, PA-9.7%b; UCT: TI-0.7%a, PA-5.7%b. Apresentaram também capacidade de diferencia??o in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas pós criopreserva??o por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram viabilidade de 80%. Estes resultados indicam que MA e TCU, obtidos tanto no momento de parto como em abatedouro, de fetos bovinos podem ser utilizados como fonte n?o invasiva e indolor de CTMs e possibilitam a forma??o de bancos de armazenamento de células.