Dise?o y validación analítica de una PCR dúplex para la detección de Ehrlichia y Rickettsia en garrapatas.

摘要

Resumen Antecedentes: Ehrlichia spp. y Rickettsia spp. son dos de los principales géneros rickettsiales transmitidos por garrapatas que afectan a animales silvestres, domésticos y humanos alrededor del mundo. Objetivo: Dise?ar y validar una prueba PCR dúplex para Ehrlichia y Rickettsia en garrapatas. Métodos: La validación de la prueba incluyó ensayos de sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y robustez. En la PCR se usó groEL y ARNr 23S como genes blanco para Ehrlichia y Rickettsia, respectivamente. Resultados: El límite de detección fue de 100 copias del gen por 50 μL de reacción para Ehrlichia spp y una copia del gen de Rickettsia por 50 μL de reacción. En general, los cebadores de la prueba solo amplificaron in silico los agentes bacterianos para los cuales fueron originalmente dise?ados, con la excepción de los cebadores de Rickettsia que también amplificaron Methylocystis sp. La prueba fue reproducible (precisión intermedia) en un 96.7% de las veces para ambos agentes. La prueba fue suficientemente robusta como para tolerar cambios de concentración de los diferentes reactivos, con excepción de la Taq DNA polimerasa. Conclusión: Los resultados de validación indican que la PCR es útil para detectar ambos géneros bacterianos y podria usarse para validación diagnostica.↓Resumo Antecedentes: Ehrlichia e Rickettsia s?o dois dos principais gêneros de rickettsias transmitidos por carrapatos que infectam tanto animais selvagens quanto animais domésticos e até homens em todo o mundo. Objetivo: O objetivo principal foi elaborar e validar uma PCR duplex para Ehrlichia e Rickettsia em carrapatos. Métodos: A valida??o incluiu testes de sensibilidade, especificidade, reprodu??o e robustez. Para o PCR, utilizamos os genes groEl e 23Sr-RNA para Ehrlichia e Rickettsia, respectivamente. Resultados: O limite de detec??o foi de 100 cópias de genes por 50 ml de rea??o para Erliquia spp e uma cópia de gene de Rickettsia por 50 ml de rea??o. Em geral, os iniciadores dos testes amplificaram em modelos computacionais os agentes bacterianos para os quais eles foram projetados, exceto os primers de Rickettsia que também amplificou Methylocystis sp. Os testes foram reproduzíveis (precis?o intermediária) 96,7% para ambos os agentes e foram também robustos para tolerar mudan?as de concentra??o em todos os reagentes, exceto o reagente Taq DNA polymerase. Conclus?es: Os resultados da valida??o indicaram que o PCR é útil para detec??o em ambos os gêneros bacterianos, portanto, um bom exame para valida??o diagnóstica.