Aplicaci贸n de la t茅cnica de reacci贸n en cadena de la polimerasa para la detecci贸n de secuencias de Papillomavirus humano

摘要

Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para la detección de secuencias de Papillomavirus humano (PVH) mediante controles de líneas celulares de cáncer cervical y tejidos obtenidos por biopsia con diagnóstico clínico positivo a PVH. Se utilizó un juego de oligonucleótidos consenso, que son complementarios a una región altamente conservada dentro del marco de lectura abierta E1 del genoma viral de los PVH que afectan la mucosa cervical. Con este juego de cebadores fue posible amplificar secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) correspondientes a los PVH 6 y 11, considerados dentro del grupo de bajo riesgo y de los PVH 16, 18, 31 y 33 comprendidos en el grupo de alto riego. El estudio de la sensibilidad de la técnica de amplificación arrojó como resultado un nivel de detección de 3,5 partículas virales por cada genoma diploide celular. Descriptores DeCS: PAPILLOMAVIRUS HUMANO/genética; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN/métodos; GENOMA VIRAL; ADN VIRAL/genética. La familia Papovaviridae está constituida por un grupo heterogéneo de virus. Hasta el presente han sido identificados 77 genotipos diferentes de Papillomavirus en humanos. En la actualidad se ha podido determinar de forma parcial la secuencia de aproximadamente 30 tipos adicionales de Papillomavirus humanos (PVH), lo cual sugiere la existencia de un número total de 100 genotipos de PVH. De los 77 tipos cuyas secuencias han sido estudiadas por completo, más de 40 infectan la mucosa cervical y representan un grupo importante de patógenos que producen enfermedades de origen epitelial.1 La infección por PVH tiene una alta incidencia y demostrada asociación con el cáncer cervical.2 Una de las más fuertes evidencias de la función que desempeña este virus en la carcinogénesis lo constituye la presencia del ADN viral en más del 90 % de los carcinomas celulares escamosos del tracto genital.3,4 Se reconoce la vía sexual como la más común de diseminación del virus.5 La infección del cuello uterino por PVH puede ser asintomática o provocar una serie de manifestaciones que varían desde la presencia de condilomas benignos hasta la ocurrencia de alteraciones displásicas de diferentes grados y cáncer. La distinción de los diferentes estadios patológicos tiene un alto valor pronóstico ya que mientras los condilomas casi siempre permanecen como lesiones benignas, las neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC) tienen una alta potencialidad de progresar al cáncer invasivo.6 Debido a la falta de un sistema celular susceptible para el aislamiento e identificación del virus y a la ausencia de pruebas serológicas adecuadas, el diagnóstico de la infección por PVH ha estado basado fundamentalmente en la detección del ácido nucleico viral.7 Desde la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) como nueva técnica para el diagnóstico, el estudio y análisis del ADN sufrió un vuelco tanto al nivel clínico como al investigativo. El método involucra la amplificación selectiva de secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante síntesis enzimática, y constituye hasta el momento la técnica más sensible empleada en la detección del ADN de PVH. La RCP permite identificar un solo tipo viral, con la utilización de cebadores que se unan a secuencias específicas de éste o puede detectar un amplio espectro de tipos mediante cebadores generales o consenso.8 El presente trabajo tiene como objetivo aplicar la tecnología de la RCP para la detección de ADN de PVH empleando un juego de oligonucleótidos consenso correspondiente a una región altamente conservada dentro del genoma viral (región E1). Con estos cebadores nos propusimos determinar la sensibilidad y factibilidad de la técnica para amplificar secuencias de los tipos de PVH que se presentan con mayor frecuencia en el tracto genital. Contorni y Leoncini9 publicaron las secuencias de estos cebadores para su empleo en la amplificación de muestras parafinadas. Sin embargo, en nuestras condiciones, nos trazamos introducir la modificación de aplicar esta metodología a la detección de secuencias de PVH en muestras frescas de tejidos endocervicales obtenidos por biopsia con un diagnóstico clínico sugestivo de infección por PVH. Mé