Extraction of membrane cholesterol disrupts caveolae and impairs serotonergic (5-HT_2A) and histaminergic (H₁) responses in bovine airway smooth muscle: role of Rho-kinase

摘要

Some receptors and signaling molecules, such as Rho-kinase (ROCK), localize in caveolae. We asked whether the function of histamine receptors (H₁) and 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptors (5-HT_2A) in bovine tracheal smooth muscle are modified after caveolae disruption and if so, whether the altered ROCK activity plays a role in this modification. Methyl-β-cyclodextrin (MβCD), used to deplete membrane cholesterol, was shown to disrupt caveolae and diminish sustained contractions to histamine (~80%), 5-HT (100%), α-methyl-5-HT (100%), and KCl (~30%). Cholesterol-loaded MβCD (CL-MβCD) restored the responses to KCl and partially restored the responses to agonists. ROCK inhibition by Y-27632 diminished contractions to histamine (~85%) and 5-HT (~59%). 5-HT or histamine stimulation augmented ROCK activity. These increases were reduced by MβCD and partially reestablished by CL-MβCD. The increase in intracellular Ca2+ that was induced by both agonists was reduced by MβCD. The presence of caveolin-1 (Cav-1), H₁, 5-HT_2A, and ROCK1 was corroborated by immunoblotting of membrane fractions from sucrose gradients and by confocal microscopy. H₁ receptors coimmunoprecipitated with Cav-1 in caveolar and noncaveolar membrane fractions, whereas 5-HT_2A receptors appeared to be restricted to noncaveolar membrane fractions. We conclude that caveolar and cholesterol integrity are indispensable for the proper functionality of the H₁ and 5-HT_2A receptors through their Rho/ROCK signaling.On trouve certains récepteurs et certaines molécules de signalisation, telle la rho-kinase (ROCK), dans les cavéoles. Nous avons examiné si les fonctions des récepteurs H₁ et 5-HT_2A dans le muscle lisse trachéal bovin changent après la destruction des cavéoles et si l'activité modifiée de la ROCK participe à ces changements. L'emploi de la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), pour épuiser le cholestérol membranaire, a détruit les cavéoles et diminué les contractions soutenues induites par l'histamine (80 %), la 5-HT (100 %), l'α-méthyl 5-HT (100 %) et le KCl (30 %). La MβCD chargée en cholestérol (MβCD-CC) a rétabli partiellement les réponses au KCl et aux agonistes. L'inhibition de la ROCK par Y-27672 a diminué les contractions induites par l'histamine (85 %) et la 5-HT (59 %). La stimulation par la 5-HT ou l'histamine a augmenté l'activité de la ROCK. Ces augmentations ont été diminuées par la MβCD et partiellement rétablies par la MβCD-CC. L'augmentation de la concentration de C2+ intracellulaire induite par les deux agonistes a été réduite par la MβCD-CC. La présence de cavéoline-1 (Cav-1), de H₁, de 5-HT_2A et de ROCK1 a été attestée par immunobuvardage de fractions de membranes sur gradients de sucrose et par microscopie confocale. Les récepteurs H₁ et la Cav-1 coimmunoprécipitent dans les fractions cavéolaires et noncavéolaires, alors que les récepteurs 5-HT_2A ont été observés dans les fractions noncavéolaires. Nous concluons que l'intégrité des cavéoles et du cholestérol est indispensable au bon fonctionnement des récepteurs H₁ et 5-HT_2A dans la signalisation liée à Rho/ROCK.