Molten globule state of human placental cystatin (HPC) at low pH conditions and the effects of trifluoroethanol (TFE) and methanol

摘要

Acid-induced conformational changes were studied in human placental cystatin (HPC) in terms of circular dichroism (CD) spectroscopy, the binding of hydrophobic dye 1-anilinonapthalene-8-sulphonic acid (ANS), and intrinsic fluorescence measurements. Our results show the formation of an acid-induced molten globule state at pH 2.0, with significant secondary and tertiary interactions that resemble the native state, exposed hydrophobic regions and the effects of trifluoroethanol (TFE) and methanol in conversion of the acid-denatured state of HPC to the alcohol-induced state, which is characterized by increased helical content, disrupted tertiary structure, and the absence of hydrophobic clusters. Alcohol-induced formation of α-helical structures at pH 2.0 is evident from the increase in the ellipticity values at 222 nm, with native-like secondary structural features at 40% TFE. The increase in helical content was observed up to 80% TFE concentration. The ability of TFE (40%) to refold acid-denatured HPC to native-state conformation is also supported by intrinsic and ANS fluorescence measurements.Key words: human placental cystatin, molten globule, acid-induced state, trifluoroethanol, methanol, CD spectroscopy, ANS fluorescence, pH, protein folding.Les changements de conformation induits par un traitement acide de la cystatine placentaire humaine (CPH) ont été étudiés par spectroscopie en dichroïsme circulaire, par liaison de colorant hydrophobe ainsi que par des mesures de fluorescence à l'acide 1-anilinonaphtalène-8-sulfonique (ANS) et de fluorescence intrinsèque. Nos résultats ont montré la formation d'un état de globule fondu induit par l'acide à pH 2,0 présentant des interactions secondaires et tertiaires significatives ayant des ressemblances avec l'état natif et exposant des régions hydrophobes. Nos résultats ont permis de comparer l'effet du trifluoroéthanol (TFE) à celui du méthanol dans la conversion de l'état dénaturé de la CPH par l'acide à l'état induit par l'alcool, qui est caractérisé par une augmentation du contenu en hélices, par la rupture de la structure tertiaire et l'absence d'agrégats hydrophobes. Les alcools induisent la formation d'hélices alpha à pH2, mises en évidence par l'augmentation des valeurs d'ellipticité à 222 nm, et de structures secondaires s'apparentant à celles de la protéine native en présence de 40 % TFE. L'augmentation du contenu en hélices a été observée jusqu'à 80 % TFE. La capacité du TFE 40 % de replier la CPH dénaturée par l'acide jusqu'à une conformation native est aussi démontrée par les mesures de fluorescence intrinsèque et à l'ANS.Mots clés : Cystatine placentaire humaine, globule fondu, état induit par l'acide, trifluoroéthanol, méthanol, spectroscopie en dichroïsme circulaire, fluorescence ANS, pH, repliement des protéines.[Traduit par la Rédaction]