Role of osmolytes as chemical chaperones during the refolding of aminoacylase

摘要

The refolding and reactivation of aminoacylase is particularly difficult because of serious off-pathway aggregation. The effects of 4 osmolytes — dimethylsulphoxide, glycerol, proline, and sucrose — on the refolding and reactivation of guanidine-denaturated aminoacylase were studied by measuring aggregation, enzyme activity, intrinsic fluorescence spectra, 1-anilino-8-naphthalenesulfonate (ANS) fluorescence spectra, and circular dishroism (CD) spectra. The results show that all the osmolytes not only inhibit aggregation but also recover the activity of aminoacylase during refolding in a concentration-dependent manner. In particularly, a 40% glycerol concentration and a 1.5 mol/L sucrose concentration almost completely suppressed the aminoacylase aggregation. The enzyme activity measurements revealed that the influence of glycerol is more significant than that of any other osmolyte. The intrinsic fluorescence results showed that glycerol, proline, and sucrose stabilized the aminoacylase conformation effectively, with glycerol being the most effective. All 4 kinds of osmolytes reduced the exposure of the hydrophobic surface, indicating that osmolytes facilitate the formation of protein hydrophobic collapse. The CD results indicate that glycerol and sucrose facilitate the return of aminoacylase to its native secondary structure. The results of this study suggest that the ability of the various osmolytes to facilitate the refolding and renaturation of aminoacylase is not the same. A survey of the results in the literature, as well as those presented here, suggests that although the protective effect of osmolytes on protein activity and structure is equal for different osmolytes, the ability of osmolytes to facilitate the refolding of various proteins differs from case to case. In all cases, glycerol was found to be the best stabilizer and a folding aid.Key words: protein aggregation, aminoacylase, chaperone, osmolytes, protein refolding.Le repliement et la réactivation de l'aminoacylase sont particulièrement difficiles à cause d'une agrégation importante. Les effets de 4 osmolytes, le diméthylsulfoxide, le glycérol, la proline et le sucrose, ont été étudiés en rapport avec le repliement et la réactivation de l'aminoacylase dénaturée à la guanidine, en mesurant l'agrégation, l'activité enzymatique, le spectre de fluorescence intrinsèque, le spectre de fluorescence au 1-anilino-8-naphtalènesulfonate (ANS) et le spectre de dichroïsme circulaire (DC). Nos résultats indiquent que tous les osmolytes inhibent non seulement l'agrégation, mais permettent de recouvrer l'activité enzymatique de l'aminoacylase lors du repliement, et ce, de façon dépendante de la concentration. Plus particulièrement, le glycérol à 40 % et le sucrose à une concentration de 1,5 mol/L ont presque complètement inhibé l'agrégation de l'aminoacylase. Les mesures de l'activité enzymatique ont révélé que l'influence du glycérol était plus significative que celle de tout autre osmolyte. Les résultats obtenus en fluorescence intrinsèque ont montré que le glycérol, la proline et le sucrose ont efficacement stabilisé la conformation de l'aminoacylase et que parmi eux, le glycérol était supérieur. Les quatre types d'osmolytes ont réduit l'exposition de la surface hydrophobe, indiquant que les osmolytes facilitent la formation de collapsus hydrophobes au sein de la protéine. Les résultats en DC ont indiqué que le glycérol et le sucrose ont facilité le retour de l'aminoacylase à sa structure secondaire initiale. Les résultats de cette étude ont suggéré que les capacités respectives des divers osmolytes à faciliter le repliement et la renaturation de l'aminoacylase ne sont pas identiques. Un examen des résultats publiés dans la littérature et des résultats de cette recherche a suggéré que malgré le fait que les effets protecteurs des osmolytes sur l'activité et la structure de la protéine soient équivalents pour les différents osmolytes, la capacité de ces osmolytes à faciliter le repliement de différentes protéines pourrait différer selon le cas. De plus, dans tous les cas, le glycérol s'est révélé le meilleur composé comme stabilisant et lors du repliement.Mots clés : agrégation des protéines, aminoacylase, chaperone, osmolytes, repliement des protéines.[Traduit par la Rédaction]