NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

摘要

目的利用p GEX-4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶(NNMT)抗原.方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMT cDNA序列,设计合成编码NNMT的DNA引物,并分别在5'端和3'端设计BamHI和XhoI位点,利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-2表达载体,重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),经异丙基-β-D-硫代乳糖苷诱导表达,Glu-tathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白(GST-NNMT).通过DNA测序来证实质粒pGEX-4T-2/NNMT的正确性,SDS-PAGE电泳以及Western-b1ot判断GST-NNMT蛋白的准确性.结果限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到p GEX-4T-2多克隆位点,成功构建表达质粒p GEX-4T-2/NNMT.菌液超声破碎后,融合蛋白主要存在于裂解上清液中,表达量约占菌体总蛋白表达量的20%,每升菌液可表达融合蛋白约4.5mg.Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT.结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT,为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础.