天麻抗真菌蛋白GAFP-Ⅰ的一级结构和cDNA克隆

摘要

天麻抗真菌蛋白ＧＡＦＰ－Ⅰ是从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ）顶生球茎分离的１４ｋＤ蛋白，它能强烈抑制腐生真菌菌丝的生长，在天麻限制和防止密环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ）侵染球茎的防卫机制中起重要作用。本文报告ＧＡＦＰ－Ⅰ的一级结构和ｃＤＮＡ克隆的核苷酸序列。首先测得Ｎ－末端７个氨基酸序列为ＳＤＲＬＮＳＧ－用以合成一个简并引物，由天麻营养球茎提取ＲＮＡ，通过３′－ＲＡＣＥ技术扩增到一个６００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥ－Ｔ载体中测定核苷酸序列。根据ｃＤＮＡ核苷酸序列和用羧肽酶Ａ测得ＧＡＦＰ－Ⅰ的Ｃ－末端为－ＡＳＧ，确认该ｃＤＮＡ含有４２９ｂｐ编码区，它编码一条１２９个氨基酸的ＧＡＦＰ－Ｉ和１４个氨基酸的Ｃ－末端扩展肽。同时，分离和纯化ＧＡＦＰ－Ⅰ经过羟胺裂解和α－糜乳胰蛋白酶消化产生的肽段，经自动Ｅｄｍａｎ降解程序测出它们的氨基酸序列。结果表明，由此测出的ＧＡＦＰ－Ⅰ氨基酸序列和由ｃＤＮＡ核苷酸序列推导出的序列９８４％一致。ＧＡＦＰ－Ⅰ由１２９个氨基酸组成，富含Ａｓｎ（１９）、Ｇｌｙ（１４），２９和５２位间有一对双硫键，计算分子量为１３９５８Ｄａ。ＧＡＦＰ－Ⅰ与雪花莲（Ｇａｌａｎ?