鲢鱼肌球蛋白重链球状结构域的cDNA克隆及结构解析

摘要

鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)，又名白鲢，与鲤鱼(Cyprinus carpio)和草鱼(Ctenopharyngodon idella)一样同属于鲤科鱼类，是我国淡水鱼资源中具有代表性的鱼种之一。与其它种类的淡水鱼相比，鲢鱼具有低值、高产的特点，因此，也是加工利用的主要对象。青、草、鲢、鳙鱼均属于广温性的淡水鱼类，它们的肌肉功能伴随栖息水温的变化而变化，以至于它们能够周年生活在温差极大的栖息环境中，淡水鱼所具有的这种独特的温度适应能力与其肌肉蛋白质主要是肌球蛋白性质的季节变化是密切相关的。在鱼类肌肉蛋白质中，60％以上是构成肌原纤维的蛋白质，肌原纤维蛋白是由肌球蛋白，肌动蛋白和调节蛋白等组成，肌球蛋白能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收缩等所需的物质，有“分子马达”之美誉。其中肌动蛋白和调节蛋白在肌原纤维蛋白中所占的比例较小，肌球蛋白构成了鱼肌肉肌原纤维蛋白的60-75％，它的性质主要决定了肌原纤维蛋白的性质，进而影响鱼肌肉蛋白质的加工适性。肌球蛋白分子由两条分子量约200kDa的重链亚基和四条分子量约20kDa的轻链亚基组成，重链亚基含有多种同工型(isoform)，它们分别由不同的同工型基因编码，因此，肌球蛋白具有“多基因家族”之称。同时，重链含有多个不同的结构域，如位于氨基端具有球状结构的重酶解肌球蛋白(HMM)，和位于羧基端具有α-螺旋结构的轻酶解肌球蛋白(LMM)。前者包括S1和S2,具有ATP酶的活性和与肌动蛋白结合的能力，后者具有使肌球蛋白在生理条件下形成丝状的能力，它们决定了鱼肌肉蛋白质多种重要的功能性质。S1结构域自氨基端起可以被胰蛋白酶水解为25、50和20kDa三个片段。两个表面环loop1和loop2分别位于25与50kDa片段和50与20kDa片段的连接区域，它们分别与ATP和肌动蛋白的结合位点有关，决定了肌球蛋白的“分子马达”功能。而轻链包括2条具有不同分子量的碱轻链(A1和A2)和2条相同的DTNB轻链，具有调节磷酸化途径等作用。
　　 早期的研究中，我们报道了从冬季和夏季鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)的快速肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因，分别命名为低温型(sc-w)和高温型(sc-s)。本文根据该两种同工型基因在3'端展现的明显差异，设计了2个特异性的反向引物，以鲤科鱼类肌球蛋白重链5'端的保守序列为正向引物，通过Long-PCR对编码鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型的球状结构域(Subfragmengt-1，S1)的全长基因进行了克隆和测序，并推断出它们一级结构的氨基酸序列。研究结果表明：sc-w与sc-s在S1的初级结构上显示80.5％的同源性、与已经报道的草鱼(Ctenopharyngodon idella)低温型(gc10)有97.2％的高同源性；sc-s则与草鱼中间型(gcI)和高温型(gc30)显示了分别为98.4％和97.1％的高同源性。低温型的sc-w和gc10在S1初级结构上展现的特有变异主要发生在43个氨基酸残基位点，其中15个属保守性残基。对S1区域中两个功能性的表面环loop1(与ATP结合位点有关)和loop2(与肌动蛋白结合位点有关)的结构解析发现：sc-w和gc10在两个表面环的长度、残基电荷分布和氨基酸组成等方面与其它同工型之间存在明显差异，揭示了这两个表面环的结构差异可能影响了栖息于不同环境温度下的淡水鱼的肌球蛋白“分子马达”功能。分子系统树的分析结果进一步证明了鱼类栖息环境温度对其肌球蛋白同工型的基因和功能歧化的影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引 言

1.1我国水产资源及其利用现状

1.2鱼类肌肉蛋白质的特点

1.2.1鱼类蛋白质的组成

1.2.2淡水鱼类栖息环境的特点及其对肌肉蛋白质功能性质的影响

1.2.3肌球蛋白概述

1.3鱼类肌球蛋白国内外研究进展

1.3.1淡水鱼肌球蛋白热稳定性的变化与环境温度之间的关系

1.3.2肌球蛋白在鱼糜凝胶过程中的作用

1.3.3淡水鱼肌球蛋白多基因家族的研究

1.4本研究的目的和意义

第二章实验材料和一般方法

2.1实验材料

2.1.1实验鱼

2.1.2实验试剂

2.2主要试剂的配制

2.3仪器和设备

2.4引物设计

2.5实验方法

2.5.1琼脂糖凝胶电泳

2.5.2 DNA纯化

2.5.3感受态细胞制备

2.5.4连接反应

2.5.5重组质粒的转化

2.5.6蓝白斑筛选和PCR快速鉴定重组菌落

2.5.7 DNA测序

2.5.8数据分析

第三章鲢鱼肌球蛋白S1重链同工型基因的cDNA克隆

3.1实验方法

3.1.1不同季节鲢鱼骨骼肌总RNA提取

3.1.2 cDNA第一链的合成

3.1.3通过Long-PCR法对编码鲢鱼肌球蛋白重链全长的基因进行PCR扩增

3.1.4分段扩增S1重链的全长基因

3.1.5克隆

3.2结果与讨论

3.2.1 RT-PCR法对两种肌球蛋白重链同工型基因的cDNA扩增结果

3.2.2编码两种肌球蛋白S1重链同工型的全长cDNA的测序结果

3.2.3鲢鱼两种S1重链cDNA与其他动物之间肌球蛋白S1重链同工型的DNA同源性比较

3.3本章小结

第四章鲢鱼肌球蛋白S1重链同工型基因的氨基酸序列分析

4.1基于cDNA序列的鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型的氨基酸序列推断

4.2鲢鱼肌球蛋白S1重链同工型的初级结构比较

4.3鲢鱼肌球蛋白S1重链的两个表面环loop1和loop2的氨基酸组成比较

4.4基于分子系统树的肌球蛋白S1重链同工型的进化分析

4.5本章小结

第五章结论和展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

论文发表与参加会议