联合液相-质谱分析和网络药理学方法探讨清热活血方防治动脉粥样硬化的作用机制

摘要

目的联合液相-质谱(liquid-mass spectrometry,LC-MS)分析和网络药理学方法探究由清热活血方防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的潜在靶点。方法首先,采用LC-MS定性分析对清热活血方化学成分进行鉴定,并将得到的成分输入Swiss Target Prediction数据库进行目标靶点预测,并采用Cytoscape 3.7.1构建清热活血方活性成分-核心靶点网络;其次,从疾病数据库中收集AS相关靶点;将AS相关靶点与清热活血方靶点取交集,得到清热活血方抗AS靶点,并制作靶标蛋白相互作用网,然后进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。之后,随机将50只雄性ApoE^(-/-)小鼠分为空白组、模型组、清热活血方低、中、高剂量组,并通过高脂饮食的方式建立ApoE^(-/-)小鼠AS模型,清热活血方组给予低、中、高剂量药物干预,16周末取主动脉组织,对筛选出的通路进行基因和蛋白水平的验证。最后,将LC-MS定量分析筛选出含量最高的两个成分,与筛选出的通路基因进行分子对接,将靶基因进行二次筛选。结果LC-MS分析清热活血方共筛选出中68个活性成分,对应靶标223个;通过检索疾病数据库,去除重复后共得到与AS相关疾病靶点3291个;将清热活血方对应靶标与AS靶点取交集得到136个核心基因。GO富集分析结果显示包含炎症反应的调控、膜微域和配体-激活转录因子活性等的参与;KEGG通路富集分析结果显示涉及PI3K/Akt等47条清热活血方抗AS信号通路。WB和RT-qPCR结果提示,清热活血方可以下调p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt水平,且可下调PI3K/Akt通路的13个基因表达水平。LC-MS定量分析得出黄芩苷和丹酚酸B是含量最多的两个成分,与PI3K/Akt通路上的13个基因进行分子对接,结果提示RXRA基因与黄芩苷和丹酚酸B自由结合能最低。结论清热活血方可能通过介导RXRA基因调控PI3K/Akt信号通路实现抗AS作用,本研究为清热活血方干预AS提供新思路和新靶点。