小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建

摘要

目的 构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并检测其功能.方法 针对小鼠TREM2基因设计合成3对shRNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因shRNA重组慢病毒载体(TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shR-NA-3).用重组载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)后,进行滴度测定.取对数生长期BV2小胶质细胞,分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组.TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、shRNA空质粒,空白组不做任何处理.感染120 h取各组细胞,Q-PCR法检测各组TREM2mRNA,计算细胞沉默效率.结果 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T后镜下均观察到GFP,包装浓缩的慢病毒滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108)TU/mL.与空白对照组和阴性对照组比较,TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 mRNA相对表达量均降低(P均<0.05);与TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-3感染组比较,TREM2-shRNA-2感染组TRME2 mRNA相对表达量降低(P均<0.05).TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49.4％ ±3.98％、79.7％ ±2.01、65.3％ ±2.41％和39.2％ ±6.98％,TREM2-shRNA2组沉默效率最高.结论 成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3.TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达,以TREM2-shRNA-2沉默效果最好.