荔枝果皮BPox的分离纯化及其在果实成熟过程中的表达

摘要

[目的]植物第Ⅲ类过氧化物酶具有广泛的生理功能.前期研究发现荔枝果皮具高活性的离子结合态过氧化物酶(BPox),与果实的着色、成熟密切关联,但其特性、作用机制不清楚.明确BPox的生化特性及其基因表达变化,为进一步研究BPox参与荔枝果实着色和成熟机制奠定基础.[方法]以'乌叶'荔枝成熟果果皮为材料,通过提取及Streamline Phenyl、CM-52、Phenyl Sepharose HP和Superdex 200等柱层析,纯化获得BPox.测定BPox的最适反应pH、最适反应温度、底物特异性、抑制剂等生化特性.采用双倒数法测定其催化愈创木酚、(?)-表儿茶素的Km值及Vmax.应用MALDI串联质谱鉴定BPox的肽段序列,克隆BPox的cDNA.分别测定盛花后58、69、76、80和90 d荔枝果皮BPox的活性变化,应用荧光定量PCR分析BPox的基因表达变化.[结果]从荔枝果皮纯化得到BPox最主要的2个组分,分别命名为BPox-2和BPox-3.凝胶过滤层析和SDS-PAGE结果显示,BPox-2和BPox-3的表观分子量分别约为30 kD和34 kD.BPox-2和BPox-3的最适反应pH均为6.0,最适反应温度分别为40°C和45°C;二者具有相似的底物特异性;DTT、ASA和L-Cys等能强烈抑制其活性.BPox-2和BPox-3催化愈创木酚的Km值分别为2.97和2.58 mmol·L-1,其Vmax分别为38.72×106和23.06×106 U·mg-1;其催化(?)-表儿茶素的Km值分别为3.49和3.24 mmol·L-1,Vmax分别为38.72×106和23.06×106 U·mg-1.尽管BPox-2和BPox-3的肽质量指纹(PMF)不同,串联质谱分析显示,二者均具一个序列为TASLSAANSDLPSPFADLATLIAR的胰酶水解肽段.克隆得到BPox2的cDNA,大小为960 bp,共编码319个氨基酸.cDNA编码的多肽链N端包含1段26个氨基酸残基的信号肽,C端缺乏液泡分选序列,具1个潜在的N-糖基化修饰位点.幼果期,荔枝果皮BPox的活性表现弱;至盛花后76 d,果皮开始着色变红,BPox的活性迅速启动升高直至果实成熟.qPCR的结果显示,在盛花后的58和69 d,果皮BPox2的转录水平很低;盛花后76 d,BPox2的表达急剧上升,达到高峰,为盛花后69 d的60.56倍,而后下降.至盛花后90 d,其表达水平又显著上升.[结论]荔枝果皮的BPox-2与BPox-3最适反应pH、最适反应温度、底物特异性等与荔枝果皮可溶性Pox组分相似,但其对愈创木酚和(?)-表儿茶素的催化效率显著高于SPox.BPox-2与BPox-3同为BPox2所编码,因翻译后修饰差异而形成同工酶.BPox参与荔枝果皮的着色和成熟进程,其活性受转录水平调控.