水稻广谱抗稻瘟病基因PigmR功能标记的开发及应用

摘要

[目的]稻瘟病是世界上最严重的水稻病害之一.通过功能标记的开发,为加快广谱持久抗稻瘟病基因PigmR在水稻育种中的应用提供依据.[方法]利用Snapgene 2.3.2软件分析PigmR的碱基变异特征,用Oligo7设计特异功能标记.为了避免因PCR扩增失败引起的假阴性,设计扩增内参基因Actin1的引物作为参照,对功能标记进行优化.用功能标记对水稻亲本材料、丽江新团黑谷的单基因系材料、育种中间材料和南粳53045/谷梅4号BC1F3群体株系进行鉴定.稻瘟病鉴定的供试菌株为江苏省稻瘟病代表菌株(2018-4、2018-65、2018-102、2018-222和2018-241)的混合菌.将供试菌株移植RCA培养基上,25℃培养7d,用黑光灯照射72h,待稻瘟病菌产生孢子后,再用无菌水洗下,配成10×10倍显微镜下每视野30-40个孢子的悬浮液.于水稻抽穗前3-4 d注射混合菌株,每穗注射1 mL菌液,做好标记.在水稻灌浆饱满后进行抗性调查.[结果]根据PigmR与PigmS、Pigm-R4序列比对及差异分析,设计了8对分子标记引物.通过分子检测,筛选获得的PigmR功能标记GMR-3,能特异扩增来源于谷梅4号的PigmR,获得98 bp产物,而不携带PigmR扩增不出产物.以不同浓度配比优化GMR-3与内参基因Actin1检测引物Actin1-1,发现以0.4μmol·L-1GMR-3与0.1μmol·L-1 Actin1-1组合浓度扩增出PigmR和Actin1特征条带的效率相当,效果最优,将该标记命名为GMRA.用该标记扩增水稻样品,携带PigmR的样品能扩增出146和98 bp条带,不携带PigmR的样品仅能扩增出146 bp条带.利用GMRA标记检测229份水稻材料,只有谷梅4号能扩增出146和98 bp条带,其他籼稻和粳稻均只能扩增出146 bp条带.进一步对29份丽江新团黑谷的单基因系材料进行检测发现,GMRA标记能有效区分PigmR与Pi9、Piz、Piz-t等同源性较高的基因,有很好的特异性.利用GMRA标记,从240份育种中间材料中筛选到3份携带PigmR的材料,可作为该基因的供体材料.利用该标记进行分子标记辅助选择,将PigmR通过回交转育到优质食味粳稻南粳53045.对南粳53045/谷梅4号BC1F3群体单株进行分子标记检测及稻瘟病人工接种鉴定,发现携带PigmR的单株均表现为抗或中抗,不携带PigmR的单株均表现为高感,表明导入PigmR能显著改良南粳53045的穗颈瘟抗性.[结论]PigmR的功能标记能有效用于抗稻瘟病遗传改良和资源筛选.