拮抗细菌KRS022的鉴定及对大丽轮枝菌的抑制效果

摘要

【目的】明确拮抗细菌KRS022的分类地位及对多种病原真菌的抑制作用,重点研究对作物黄萎病的防治效果及其对病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抑制效果,为抗大丽轮枝菌生防制剂的研发提供资源。【方法】通过形态学、生理生化试验及16S rDNA与gyrB基因序列串联分析确定KRS022的分类地位;采用对峙培养法和对扣熏蒸法测试KRS022对多种真菌的抑制作用;采用发酵菌液平板法、涂布法以及对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌的平板抑制效果;通过无细胞上清共培养法与对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝形态的影响;通过盆栽试验及大丽轮枝菌生物量测定明确KRS022对棉花和烟草黄萎病的防治效果;利用RT-qPCR法检测KRS022激发植物免疫相关基因的表达特性。【结果】拮抗菌株KRS022为革兰氏阴性细菌,鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。该菌株具有解磷、解钾、固氮功能,可产生嗜铁素,具有蛋白酶、淀粉酶、过氧化氢酶活性,属于好氧产碱型细菌,100μg·mL^(-1)氨苄青霉素可作为该菌株的天然抗性筛选条件。KRS022对多种病原真菌(大丽轮枝菌、尖镰孢、禾谷镰孢、稻瘟病菌、灰葡萄孢、胶孢炭疽菌、果生炭疽菌)均具有不同程度的抑菌活性,对峙和对扣培养对大丽轮枝菌Vd991的抑制率分别达75.19%和99.78%。发酵菌液平板法、涂布法以及对扣熏蒸法对大丽轮枝菌的抑制率分别为96.21%、99.72%和99.44%,均能显著抑制Vd991菌丝生长;KRS022无细胞上清液与大丽轮枝菌分生孢子共培养完全抑制孢子萌发,对扣熏蒸后Vd991菌丝发生膨大、变粗。室内盆栽试验结果表明KRS022能够显著抑制棉花和烟草黄萎病的发生,并发现对植株具有促生作用,与清水处理的烟草盆栽相比,施用KRS022菌液的烟草盆栽的叶维度及单叶面积增幅分别达65.7%和146.4%;施用KRS022菌液后大丽轮枝菌在植株中的生物量显著减少,棉花和烟草对照组(单独接种Vd991)中大丽轮枝菌的生物量分别是处理组(KRS022+Vd991)的1.75和2.57倍。同时KRS022能够激发植物防御反应相关基因的表达,经KRS022处理的棉花植株中水杨酸(SA)通路标记基因GhPR1、茉莉酸(JA)通路标记基因GhAOC4和乙烯(ET)通路标记基因GhEIN2均显著上调表达,上调倍数分别是清水处理的7.23、1.69和15.05倍;经KRS022菌液处理后再接种大丽轮枝菌的棉花植株,GhAOC4和GhEIN2被显著诱导表达,上调倍数分别是只接种大丽轮枝菌的68.09和11.87倍;经KRS022无细胞上清液注射处理后NbHSR203、NbHIN1、NbPR1、NbPR2、NbPR5、NbRbohA、NbRbohB上调表达倍数分别是空白LB处理的1.98、2.79、2.52、1.25、1.70、3.28、3.44倍,均显著上调表达。【结论】拮抗细菌KRS022鉴定为产碱假单胞菌,能够产生铁载体,具有解磷、解钾、固氮并促进植物生长的潜力。对多种病原真菌均具有抑制效果,能够抑制大丽轮枝菌菌丝生长及孢子萌发,具有防治黄萎病及激发植物免疫反应的作用,是一株具有开发前景的防治黄萎病等真菌病害的生防微生物资源。