ROCK抑制剂Y-27632在体外培养的兔角膜内皮细胞紫外线损伤修复中的作用

摘要

目的 探讨ROCK抑制剂Y-27632在兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells,RCECs)紫外线损伤修复中的作用.方法 收集30只健康成年新西兰大白兔的角膜,显微镜下撕除角膜后弹力层和内皮层,用胰蛋白酶消化法获得原代RCECs.选取第2代处于对数生长期的RCECs分为三组:A组为正常对照组,RCECs为常规培养液培养;B组为紫外线照射组,RCECs经紫外线照射20 s制备细胞损伤模型,常规内皮细胞培养液培养;C组为紫外线照射+Y-27632组,在细胞损伤模型中加入终浓度10μmol·L-1的Y-27632细胞培养液培养.采用MTT比色法检测各组细胞活性.采用Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力.利用BrdU细胞增殖实验检测各组细胞的增殖能力.运用细胞黏附实验检测各组细胞黏附性.采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞周期蛋白(CyclinD1)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKN1B)mRNA的相对表达量.Western blot法检测各组CyclinD1和细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk2)的表达情况.结果 MTT比色法检测结果显示,B组细胞的活性(80.61±3.40)％低于A组(100％)和C组(92.55±4.56)％,差异均有统计学意义(P=0.000、0.025).Transwell迁移实验结果显示,B组迁移细胞数目[(39.3±4.4)个/高倍视野]较A组[(77.0±6.7)个/高倍视野]和C组[(54.3±3.4)个/高倍视野]减少,差异均有统计学意义(P=0.023、0.015).BrdU细胞增殖实验检测结果显示,B组细胞光密度值(0.24±0.05)较A组(0.35±0.08)和C组(0.30±0.07)降低,差异均有统计学意义(P=0.001、0.015).细胞黏附实验结果显示,B组细胞黏附性(0.183±0.010)较A组(0.541±0.010)和C组(0.353±0.030)下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000).实时荧光定量PCR检测结果显示,与A组相比,B组的CyclinD1 mRNA相对表达量(0.49±0.10)下降,CDKN1B mRNA相对表达量(1.25±0.20)上调,差异均有统计学意义(P=0.003、0.002);C组CyclinD1 mRNA的相对表达量(0.80±0.12)比B组(0.49±0.10)增加,C组CDKN1B mRNA的相对表达量(0.90±0.16)比B组(1.25±0.20)减少,差异均有统计学意义(P=0.013、0.022).Western blot检测结果显示,B组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.21±0.09)和(0.38±0.10),均低于A组(0.43±0.12)、(0.62±0.19),差异均有统计学意义(P=0.014、0.005);C组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.34±0.11)和(0.51±0.14),均高于B组,差异均有统计学意义(P=0.027、0.002).结论 ROCK抑制剂Y-27632能增强紫外线损伤的RCECs活性,促进细胞迁移、黏附和增殖.