蛋白激酶C抑制剂Staurosporine对A类清道夫受体胞浆域结构去除后功能的影响

摘要

A类清道夫受体(scavenger receptor,SR-A)是一种主要位于巨噬细胞膜表面的同源三聚体糖蛋白,能够结合和摄取多种配基并介导内移.在清道夫受体胞浆域有几个潜在的磷酸化位点,有关这些磷酸化位点与受体功能之间的确切关系目前尚所知甚少.为深入探讨A类清道夫受体胞浆域与磷酸化之间的关系,以及受体胞浆域磷酸化对受体功能的影响,实验以含有SR-A cDNA质粒为模板,采用PCR方法扩增不含胞浆域序列的清道夫受体,同时扩增全长清道夫受体作为对照.PCR产物经纯化酶切后,进一步亚克隆到PcDNA3.1/HisB中,测序结果表明,重组产物能够编码正确的氨基酸序列.重组产物经脂质体Lipofectamine(LF2000)介导转化入CHO细胞中,在含G418选择性培养液中培养筛选14天后,分离阳性克隆,继续培养.采用流式细胞计数仪(FACS)鉴定转化筛选后细胞能否表达具有功能的清道夫受体.结果发现,转化的CHO细胞可以稳定表达SR-A的蛋白质,但受体胞浆域去除后,摄取配基的能力明显弱于全长组(1:1.337).用荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-AcLDL),37℃孵育转化细胞5 h后,激光共聚焦显微镜下观察到:全长受体转化组细胞荧光散在分布于细胞膜和细胞器,而去除胞浆域组荧光只局限于细胞膜,说明SR-A胞浆域可能起着介导受体内移的作用.进一步比较蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素(staurosporine,STA)对两组细胞受体功能的影响,发现经STA处理后,全长组受体与配基的结合及摄取明显增高,而胞浆域去除后受体不受STA的调控.从而证明磷酸化药物可能是通过改变SR-A胞浆域磷酸化水平而发挥作用,受体胞浆域磷酸化可能决定着受体的内移,并参与调节受体的活性.