香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测方法的建立

摘要

我国的养殖香鱼正面临着严重的香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)感染.本研究联合运用环介导等温扩增技术(LAMP)和横向流动试纸条(LFD)的检测技术,建立了快速便捷地检测G.plecoglossi的LAMP-LFD方法.该方法以G.plecoglossi的β微管蛋白基因为检测靶标,在其保守区域设计并筛得6条特异性引物(其中上游内引物用生物素标记),进行LAMP反应,产物再与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的特异性探针杂交,在LFD上进行结果判断.结果表明,LAMP-LFD方法能够特异性地检出G.plecoglossi,对梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌香鱼分离株、杀香鱼假单胞菌,以及香鱼组织等的检测均呈阴性.优化后,LAMP的反应条件为65℃反应45min,与探针杂交的条件为65℃反应5min,加之5min的显色时间,整个检测时程为55min.利用该方法能够检测到2.0fg/μL的含β微管蛋白的质粒DNA,针对G.plecoglossi基因组DNA的检测灵敏度为14.0pg/μL;能够从感染强度达到100个虫体/克的香鱼肝组织中稳定地检测到虫体.该方法可在简单的恒温加热设备(如水浴锅)中完成核酸扩增和探针杂交,无需昂贵的仪器装置.综上,香鱼格留虫LAMP-LFD方法操作便捷、灵敏度高、特异性好、检测快速,而且设备依赖性低,完全适合于基层检测的需求.