新型Tet-On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

摘要

目的通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet-On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害.方法首先在pAAV-GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA2s-S2和四环素反应元件(TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV-rtTA2s-S2-TRE-GDNFflag.与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ-PCR)检测病毒效价.rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA2s-S2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控.结果体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在2周内表达(32.6 pg/ml±2.6 pg/ml),高于强力霉素阴性组(10.1 pg/ml±2.4 pg/ml),差异有统计学意义.结论 Tet-On反式激活因子rtTA2s-S2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s-S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达.