利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

摘要

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果。使用高通量测序的方法进行基因表达分析。用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能。