醛缩酶A基因真核表达载体的构建及其生物学活性分析

摘要

目的 构建带FLAG标签的醛缩酶A(ALDOA)基因的真核表达载体,对其表达产物进行功能检测.方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增ALDOA基因,将其克隆至真核载体pcDNA3.0-FLAG中.经过酶切与测序验证,转染人胚肾293T细胞系,利用蛋白质免疫印迹实验完成其表达鉴定.转染人乳腺癌细胞MCF7和ZR75-1,使用葡萄糖摄取试剂盒检测细胞糖摄取情况,乳酸试剂盒检测细胞外乳酸产量.通过细胞生长曲线及克隆形成实验探究pcDNA3.0-FLAG-ALDOA对乳腺癌细胞生长的影响,通过划痕实验探究ALDOA对乳腺癌细胞迁移能力的影响.结果通过PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约1100 bp cDNA片段,克隆到pcDNA3.0-FLAG载体上,测序结果与目的序列完全一致.转染人胚肾293T细胞后,pcDNA3.0-FLAG-ALDOA基因表达成功.糖摄取及乳酸含量鉴定结果表明,pcDNA3.0-FLAG-ALDOA对乳腺癌MCF7和ZR75-1细胞糖摄取及乳酸的生成有促进作用;生长曲线及克隆形成实验结果表明,pcDNA3.0-FLAG-ALDOA可促进乳腺癌MCF7和ZR75-1细胞生长;迁移实验结果表明,pcDNA3.0-FLAG-ALDOA可促进乳腺癌MCF7和ZR75-1细胞迁移.结论FLAG-ALDOA真核表达载体构建成功,表达产物ALDOA具有生物学活性,可促进乳腺癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、细胞生长及迁移,为进一步研究ALDOA在肿瘤发展中的意义奠定了理论基础.