人KRAS真核表达载体的构建及生物学功能鉴定

摘要

目的 构建带FLAG标签的Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)真核表达载体,获得其表达产物并鉴定同源二聚体.方法 应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出KRAS全长编码区基因,将其克隆到pCMV-FLAG2B载体中,BamHⅠ、XhoⅠ双酶切及测序得到阳性克隆;利用重组质粒转染人胚肾293T细胞,以SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测FLAG2B-KRAS与Myc-KRAS的相互作用.结果 双酶切和基因测序显示,FLAG2B-KRAS真核表达载体构建成功;SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,FLAG2B-KRAS转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀结果显示,FLAG2B-KRAS与Myc-KRAS在蛋白水平上具有相互作用,能形成同源二聚体,证明其具有生物学活性.结论 成功构建FLAG2B-KRAS真核表达载体,为进一步探讨KRAS在肿瘤分子生物学中的作用及靶向治疗奠定了实验基础.