中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

摘要

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV (BTV-l、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行.[目的]建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障.[方法]根据我国流行BTV基因节段2(Seg-2)序列设计引物和TaqMan探针,对引物的特异性与敏感性进行评估;以12种血清型BTV毒株和核酸阳性血液样本验证建立的血清型RT-qPCR检测方法;将其应用于库蠓与动物血液样本中BTV的定型.[结果]建立的BTV血清型RT-qPCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,反应的扩增效率(E)值＞90.3％,相关系数(R2)值在0.991-0.999之间,对12种血清型BTV核酸的检测下限在25-48拷贝之间.对165株BTV的RT-qPCR定型结果与病毒的Seg-2测序鉴定结果一致;对194份采集于哨兵动物的BTV核酸阳性血液样本的RT-qPCR定型结果与感染动物上分离BTV的血清型一致.采用建立的方法,从2019年云南省师宗县与景洪市采集的库蠓与牛血液样本中鉴定出6种血清型的BTV (BTV-1、-2、-4、-5、-16和-24).[结论]研究建立的12种BTV血清型RT-qPCR定型方法具有特异、敏感和省时的优点,可用于媒介与动物感染BTV的血清型定型,具有良好的应用与推广价值.