丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

摘要

目的筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因.方法以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcKNA3.(-)为平行对照.提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索,比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终上上密码子下游保守的多聚苷腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转杂了PcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录致聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果该新基因的编码序列全长为1 572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册,注册号为AF529364.结论分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NS5A反式激活作用的机关报型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HbxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治序技术奠定基础.