人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

摘要

目的 构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础.方法 利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度.将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达.结果 重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1 a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液.病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强.结论 通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体.