携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

摘要

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征。首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGloxΔE1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度。双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性。酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因。融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性。结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础。